Eine Reise durch die Physiologie - Wie der Körper des Menschen funktioniert
 

     
Humoral-neuronale Steuerung und Kontrolle von Organsystemen

Wie werden Hormonaktivitäten bestimmt?

© H. Hinghofer-Szalkay

Aschheim-Zondek-Test: Selmar Aschheim, Bernhard Zondek
Bioassay: βίος = Leben, assay = Prüfung, Probe (exagium = Wägen)
Chromatographie: Von Michail S. Tswett benutztes Verfahren zur Trennung von Pflanzenfarbstoffen - χρῶμα = Farbe, γραφή = Aufzeichnung
Galli-Mainini-Test: Carlos Galli Mainini
in vivo = im Leben(den)
in vitro = im (Reagenz-) Glas


Die Konzentration eines Hormons im Blut spiegelt nicht unbedingt seine biologische Wirkung wider: Ist z.B. der Rezeptormechanismus an den Zielzellen defekt, bleibt die Wirkung auch bei hohen Blutwerten des Hormons aus.

Bioassays werden für Forschungs-, Entwicklungs- und Überprüfungszwecke verwendet - sie erlauben einen direkten biologischen Wirkungsnachweis (Quantifizierung eines definierten Hormoneffekts). Es gibt in-vitro-Modelle auf unterschiedlichen Komplexitätsstufen: Einzelzellen (Zellkulturen), Gewebe (z.B. Darmstreifen), Organe (z.B. Herzpräparate); oder man prüft - in vivo - an ganzen Organismen (Tiermodelle).

Im klinischen Labor werden Konzentrationswerte von Hormonen im biologischen Substrat (meist Körperflüssigkeiten) ermittelt - mit physikalischen, biochemischen oder immuntechnischen Methoden.

Analysen beruhen auf chromatographischen Verfahren
(HPLC: high performance liquid chromatography); Massenspektrometrie (Steroide, Vitamin D, Medikamente, Proteine etc.); oder auf immunchemischen Techniken (für Hormone mit antigenen Eigenschaften, die mittels Antikörpern selektiv dargestellt werden können). Die Reaktion kann eine Agglutination, Immunpräzipitation, oder Markierung des Antikörpers sein - z.B. mit enzymatischer Aktivität (z.B. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) oder mit radioaktiven Stoffen.


Bioassays Biochemische Assays

Core messages
 
Wie quanfifiziert man Hormone und ihre Wirkung?
 

Die Bestimmung von Hormonaktivitäten ist nicht einfach: Die Konzentrationswerte sind gering und die Spezifität der Wirkung liegt an der molekularen Interaktion der Hormonmoleküle mit bestimmten Rezeptoren im Gewebe. Wie also misst man die Konzentration / Aktivität eines Hormons?
 
Bioassay
  
Bioassays ermöglichen die Abschätzung der Konzentration oder Wirksamkeit einer Substanz (eines Hormons, Medikaments,..) durch die Quantifizierung der biologischen Reaktion, welche diese Substanz auslöst.

Solche (oft aufwändigen) Verfahren erlauben - im Gegensatz zur klinischen Laboratoriumsroutine - einen direkten biologischen Wirkungsnachweis, also die Quantifizierung definierter physiologischer Effekte. Sie beziehen Verfügbarkeit und Funktionsfähigkeit entsprechender Rezeptoren sowie der Folgereaktionen in der Zelle (enzymatisch, second messenger-Verstärkung, Phosphorylierungen, Genaktivierung...) ein.

Liegt irgendwo in dieser Funktionskette ein Defekt vor, ist die Hormonwirkung verändert.
Damit kommt diese Methode dem tatsächlichen physiologischen Effekt des Signalstoffs im Körper sehr nahe, aber die exakte Aufklärung des Defekts kann schwierig sein.

Beispiele reichen von

      In-vitro-Modellen (z.B. Präparate, die mit einer den Wirkstoff enthaltenden Flüssigkeit über- oder durchströmt werden) über

      Tiermodelle (Untersuchung in vivo ) bis hin zu

      klinischen Prüfungen.

      Bioassays an Zellen (in vitro : Zellkulturen), Geweben bzw. Organen (Darmstreifen, Herzpräparate etc.) werden für Forschungs-, Entwicklungs- und Überprüfungszwecke durchgeführt.

Quantifizierung: Man vergleicht den Effekt einer zu testenden Präparation mit der eines Standards (z.B. mit bekannter Menge eines Hormons); die Wirkung wird relativ quantifiziert.
 


>Abbildung: Bioassay
Nach: Luetje CW,  Receptors: Chemical courtship in mice. Nature Chemical Biol 2013; 9: 140-1

Verhaltensänderung kann als Indikator für die biologische Relevanz olfaktorischer Reize gewertet werden


Bioassays an ganzen Tieren machen es möglich, den Effekt sehr spezifischer Reize auf das Verhalten von Versuchstieren zu untersuchen (>Abbildung), wobei der Vorteil besteht, dass Reize von sehr geringer Intensität (z.B. Konzentration eines Geruchsstoffs) wirksam werden und die komplexe Reaktion mit hoher biologischer Relevanz einhergeht.

Schwangerschaftsnachweise mittels
Nachweis von hCG in Harn- oder Blutproben sind ein weiteres Beispiel. Früher benutzte man dazu genormte Tiermodelle (heute obsolet):
    
      Der Galli-Mainini-Test diente zum hCG-Nachweis über die spermatogenetische Wirkung einer in den dorsalen Lymphsack injizierten Harnprobe bei jungen Krötenmännchen ("Krötentest");
 
      beim Aschheim-Zondek-Test  wurde unreifen weiblichen Mäusen eine Harnprobe der fraglich schwangeren Frau unter die Haut gespritzt und untersucht, ob die Tiere - die obduziert werden mussten - mit einer Ovulation reagierten ("Mäusetest");

      der Friedman-Test (rabbit test) prüfte die Reaktion der Eierstöcke eines Kaninchens auf eine Harninjektion - auch diese Tiere wurden zum Zweck des Bioassays geopfert.
 
Heute verwendet man Teststreifen, deren Verfärbung die Anwesenheit von HCG anzeigt. Diese benützen Antikörper, welche das nachzuweisende Hormon spezifisch binden - die Bindung wird mittels einer (farbgebenden) Sekundärreaktion angezeigt.

Ob ein Hormon im Körper tatsächlich wirksam wird, zeigt eine Reaktion im Teststreifen allerdings nicht an; entscheidend ist das volle Funktionieren der biologischen Reaktionskette (Rezeptor in Zellmembran oder Zelle und Sekundärreaktionen, z.B. second messenger, Kinasen, Transkription etc).

 
Biochemische Assays
 

Hormonnachweise erfolgen im klinischen Labor mittels physiko-, bio- bzw. immunchemischer Methoden. Sie testen auf die Menge (Konzentration) des Hormons im biologischen Substrat (z.B. Blutplasma, Harn,..), ohne Rücksicht auf Folgemechanismen in der Zelle (die für die biologische Hormonwirkung erforderlich sind, bei Bioassays eine Rolle spielen und patientenspezifisch ausgeprägt sein können).

       Massenspektrometrie trennt Moleküle in einem Gemisch je nach ihrer molekularen Masse auf. Ein Massenspektrometer besteht aus drei Komponenten:
 
      Einem Ionisierer, der die Bestandteile in der Probe in Ionen verwandelt und diese als Gasphase zwecks Massenanalyse beschleunigt;
 
      einem Analysator, der die Partikel nach ihrem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis trennt;
 
      einem Ionendetektor, auf den die Partikel treffen. Der Impact der einzelnen Ionen wird aufzgezeichnet, bei bekannter Ladung resultiert aus der Laufzeit die Masse.
 

<Abbildung: GC-MS-Messplatz
Nach einer Vorlage in mps.mpg.de / Mars Organic Molecule Analyser

(Flüssig-) Gaschromatografie (GC) trennt gemische in einzelne Verbindungen auf, die gasförmig vorliegen oder verdampft werden können, ohne dabei zersetzt zu werden. Als mobile Phase dient ein inertes Gas (Helium, Stickstoff), das unter hohem Druck durch eine erhitzte (bis 400°C) Trennsäule (einige mm dicke, spiralig gebogene Röhre aus Quarzglas oder Metall, mehrere m lang) gepresst wird.
 
Bei der HPLC (high performance liquid chromatography, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) können auch nicht-flüchtige Stoffe getrennt und analysiert werden. Je intensiver die Substanz in der mobilen Phase mit der Wand der Säule interagiert, desto langsamer wandert sie durch die Säule.
 
Bei der Massenspekrometrie (MS) werden die zu analysierenden Substanzen nach ihrer atomaren Masse getrennt. GC-MS kombiniert die beiden Methoden und wird eingesetzt, um Bestandteile einer Lösung zu identifizieren und zu quantifizieren

Massenspektrometrie kann mit Chromatographie kombiniert werden (GC-MS, <Abbildung). Massenspektrometrisch bestimmt werden z.B. Steroide, Vitamin D, Medikamente ("individualisierte Medizin", drug monitoring), aber auch Proteine oder DNA-Amplifikate. Die chromatographische Auftrennung kann in einer Flüssigkeitsphase (>Abbildung: liquid chromatography, LC) oder in einem Trägergas erfolgen (Gaschromatographie).

Analysen, die auf chromatographischen Verfahren beruhen, nützen die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit verschiedener Moleküle in einem Gas oder einer (Körper-) Flüssigkeit ("mobile Phase") in einem Trägermedium ("stationäre Phase"). Die nacheinander an einem Sensor vorbeikommenden Molekülfraktionen werden von diesem (optisch) detektiert und das entsprechende Signal quantifiziert.

Große Moleküle (Proteine, DNA) können mit klassischer Massenspektrometrie nicht bestimmt werden (die konventionelle Ionisierung würde die Makromoleküle in Stücke reißen). Dazu wurden spezielle Verfahren der soft-ionization entwickelt, insbesondere MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight) - sie mischt die Probe mit einem organischen Lösungsmittel, aus dem heraus ein Laserstrahl die Probe schonend in die Gasphase bringt - und ESI (electrospray ionization), bei dem die Lösung durch eine Düse gepresst wird, wobei feine Tröpfchen entstehen, die beim Eintritt in den Massenspektrometer verdampfen.




>Abbildung: Beispiel einer Hormonanalyse mittels LC-MS
Nach einer Vorlage bei anzac.edu.au/research/andrology

Methode: Flüssigkeitschromatographie (LC) / Massenspektrometrie (MS). Das Hormongemisch wurde chromatographisch aufgetrennt.
 
Die Flächen unter der Kurve geben die Konzentrationen von Steroiden in der Probe an

Die jeweilige Konzentration wird auf der Y-Achse, die Zeit auf der X-Achse dargestellt. Ist eine Fraktion ausreichend klar von den anderen abgesetzt darstellbar (getrennt), zeigt sich ein entsprechender "Peak" im Chromatogramm, und die Konzentration des Stoffes kann (durch Planimetrie der Konzentrationskurve) quantifiziert werden. (Für diesen Zweck gibt es handliche Computerprogramme.)

Eine chromatographische Auftrennung einer speziellen wässrigen mobilen Phase mit sehr guter Ausbeute (hoher Druck in der Trennsäule etc.) wird als High performance liquid chromatography (HPLC) bezeichnet. Hormone können massenspektrometrisch in verschiedenen Körperflüssigkeiten (Blut, Harn, Speichel) nachgewiesen werden. Der Vorteil gegenüber immunchemischen Methoden liegt darin, dass der Nachweis nach dem Molekulargewicht absolut verlässlich ist (während Antikörper nicht immer spezifisch reagieren, Kreuzreaktionen sind nicht auszuschließen). Gekoppelt mit Chromatographie können rasch und präsize Analysen vorgenommen werden.
  

<Abbildung: Prinzip des Radioimmunoassay (RIA)
Nach einer Vorlage in Boron / Boulpaep, Medical Physiology, 3rd ed., Elsevier 2016

Links oben: Radioaktiv markiertes Hormon wird in zunehmender Menge zu hormonspezifischen Antikörpern gegeben - es resultiert eine Sättigungskurve.

Unten: Gibt man unmarkiertes Hormon zur Inkubationsmischung, nimmt die Konzentration markierter Antikörper proportional ab
.

Rechts oben:
Die entsprechende Abnahme der Aktivität der Antikörper- Hormon- Komplexe ergibt eine Verdrängungskurve. In der zu prüfenden Flüssigkeit kann so die Hormonkonzentration ermittelt werden


       Immunchemische Techniken ermöglichen sehr spezifische Detektion von Molekülen, die gute antigene Eigenschaften haben und daher mittels Antikörpern selektiv dargestellt werden können - z.B. Agglutination, Immunpräzipitation, oder mit Markierung (z.B. mit enzymatischer Aktivität oder radioaktiven Stoffen) des Antikörpers (Immunoassay: Nachweis eines gelösten Analyten durch Bindung an einen Antikörper). Ein Beispiel ist der Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), der auf einer enzymatischen Farbreaktion beruht.

Solche Methoden beruhen auf einem Verdängungsprinzip: Beispielsweise konkurrieren unmarkierte Hormonmoleküle (unbekannter, zu ermittelnder Konzentration) mit markierten (bekannter Konzentration) um Bindungsstellen an hormonpezifischen Antikörpern im Testansatz (<Abbildung). Aus der Beziehung Radioaktivität vs. Konzentration (des Hormons) ergibt sich eine Eichkurve; eine gegebene Aktivität entspricht dann der Konzentration (unmarkierten) Hormons in der betreffenden Probe.
 
 
>Abbildung: Immunoassay
Nach einer Vorlage in neb-test.de

  Die Antikörpermoleküle übernehmen verschiedene Funktionen: Der 'capture'-Antikörper bindet Protein an die Tüpfelplatte; der spezifische Antikörper erkennt das Zieleiweiß; dann bindet der enzymmarkierte Antikörper und ermöglicht die Darstellung über eine Enzymreaktion.
  
  HRP, horseradish-peroxidase (Meerrettichperoxidase) - wird zur Antikörpermarkierung verwendet     TMB, Tetramethylbenzidin, ein (von mehreren verschiedenen) Indikator(en), der durch Aktivität der Meerrettichperoxidase Farbe annimmt und die Reaktion dadurch sichtbar macht

Stresseinfluss: Hormonanalysen können auch an Haar- oder Stuhlproben erfolgen. Dies ist (wie auch bei Speichelproben) nicht mit Belastung verbunden wie z.B. die Gewinnung einer Blutprobe, bei der die Konzentration stressabhängiger Hormone (z.B. Adrenalin, Kortisol) deutlich ansteigen kann (Invasivität bedingt psychische Belastung). In der Haarwurzel lassen sich z.B. Kortisolwerte bestimmen, die repräsentativ für einen vorangegangenen Zeitraum über Wochen und Monate ist (individuelle Vorgeschichte: Stresslevel über längere Dauer).

Rasche Zeitverläufe (z.B. 24-Stunden-Profil) lassen sich so natürlich nicht verfolgen; dazu ist die frequente Analyse von Blutproben erforderlich. Um z.B. den präovulatorischen LH-Peak zu ermitteln, reichen auch Harnproben aus.

 

 
     Hormonnachweise erfolgen im klinischen Labor mittels physiko-, bio-, immunchemischer Methoden. Sie testen auf die Menge (Konzentration) des Hormons im biologischen Substrat (z.B. Blutplasma, Harn). Immunchemische Techniken detektieren Moleküle mit ausgeprägten antigenen Eigenschaften mittels Antikörpern: Agglutination, Immunpräzipitation, Markierung mit enzymatischer Aktivität oder radioaktiven Stoffen (Immunoassay). Kreuzreaktionen können das Ergebnis verfälschen
 
      Chromatographische / massenspektrometrische Verfahren (GC-MS) nützen die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle in einem Trägermedium, die nacheinander am Sensor vorbeikommenden Molekülfraktionen werden detektiert / quantifiziert. Massenspektrometrische Nachweise sind im Vergleich zu immunchemischen Methoden absolut verlässlich; bei Antikörpern können Kreuzreaktionen auftreten
 
      Physiko-, bio- oder immunchemische Messungen bestimmen lediglich Konzentrationswerte in der untersuchten Probe; ob oder wie stark ein Hormon im Körper tatsächlich wirksam wird, zeigen sie nicht an. Entscheidend ist das volle Funktionieren der biologischen Reaktionskette (Rezeptor, Sekundärreaktionen, second messenger, Enzyme, Genexpression)
 
      Bioassays messen die biologische Wirksamkeit von Hormonen über die Quantifizierung physiologischer Effekte. Zu Bioassays gehören in-vitro-Modelle (z.B. Zellkulturen, Darmstreifen, Herzpräparate), Tier- und Humanmodelle (in vivo). Bioassays werden für Forschungs-, Entwicklungs- und Überprüfungszwecke durchgeführt. Die Wirkung wird im Vergleich zu einem Standard (Referenz) angegeben (relative Quantifikation)
 
      Die Darstellung rascher Zeitverläufe (z.B. 24-Stunden-Profil eines Hormons im Kreislauf) erfordert die Analyse wiederholt abgenommener Blutproben. Die Konzentration stressabhängiger Hormone (z.B. Adrenalin, Kortisol) kann wegen Invasivität / psychischer Belastung deutlich ansteigen. Hormonanalysen können auch an Speichel-, Harn-, Haar- oder Stuhlproben erfolgen, mit unterschiedlichen Verzögerungen / Mittelungen des hormonellen Zeitprofils. Der Kortisolgehalt in Haarwurzelproben ist repräsentativ für einen Zeitraum von Wochen bis Monaten vor der Probenentnahme
 

 

Eine Reise durch die Physiologie


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