Eine Reise durch die Physiologie - Wie der Körper des Menschen funktioniert
 

  
Abwehrvorgänge (Immunologie)
 
Untersuchung des Immunsystems
© H. Hinghofer-Szalkay
Abszess: abs-cedere = sich zurückziehen, weichen (abscessus = Eitergeschwulst)
Alopezie: ἀλώπηξ = Fuchs(fell)
Osteomyelitis: ὀστέον = Knochen, μυελός = Mark
Pyodermie: πυον = Eiter, δέρμα = Haut
Soor: sohren (altdeutsch) = wundmachen (engl. sore)
Immunologische Diagnostik orientiert sich an klinischen Symptomen (Entzündungszeichen, geschwollene Lymphknoten,..), Labordiagnostik (Differenzialblutbild, Immunglobuline, Komplementfaktoren, HLA-Typisierung) und in-vivo-Assays (Hauttests).

Aufgrund der enormen Komplexität des Immunsystems können klinische Indizien zum Teil widersprüchlich erscheinen; mangelnde oder überschießende Immunaktivität (Anergie, Hyperergie) äußern sich nicht immer in Form eindeutiger Befunde.

 Immunoassays können z.B. als Radioimmunoassay (RIA) oder Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Einsatz gelangen. Bei der Durchflusszytometrie werden einzelne Zellen an einem Detektor vorbeigeführt und Färbung bzw. Markierung erfasst (Streulicht, Fluoreszenz), auch kann auf diesem Wege eine CD-Klassifizierung (Cluster of differentiation) erfolgen.


Klinische Indizien Labormethoden Nachweis zellulärer Immunfunktionen

Core messages
  
Die individuelle Beurteilung des Immunsystems folgt unterschiedlichen Pfaden: Anamnese, Untersuchung der Person, Berücksichtigung von Umweltfaktoren, Labordiagnostik. Letztere nutzt oft Reaktionen Antigen / Antikörper, wie Aggregation partikulärer Antigene (z.B. Blutgruppennachweis), Präzipitation gelöster Antigene (z.B. Immundiffusion). Assays mit markierten Antikörpern haben auch Quantifikation zum Ziel (z.B. ELISA). Mit Methoden wie Immunfluoreszenz oder Durchflusszytometrie kann die Expression von Antigen sowohl an der Oberfläche als auch im Inneren untersuchter Zellen quantifiziert werden.

Zur Quantifikation solcher Reaktionen und Vergleichbarkeit der Ergebnisse von verschiedenen Proben und in verschiedenen Laboratorien sind Antikörper mit gleich bleibenden Eigenschaften (Epitopszezifität, Bindungsstärke) notwendig. Das gelingt durch Verwendung von Antikörpern, die nicht verschiedene Bindungseigenschaften haben (polyklonalen Ursprungs sind), sondern ausschließlich von einem bestimmten Zellklon stammen (monoklonale Antikörper). B-Zell-Klone können durch Hybridisierung mit Tumor (Myelom-) zellen unsterblich gemacht und zur Gewinnung großer Mengen monoklonaler Antikörper herangezogen werden.

1984 erhielten Niels Jerne (Dänemark), Georges Köhler (BRD) und Cesar Milstein (Argentinien / UK) den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin "for theories concerning the development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies".
Klinische Beurteilung
 
Die Komplexität des Immunsystems macht seine Untersuchung zu einer vielgliedrigen Herausforderung. Die diagnostische Spannbreite liegt von molekularen bis psycho-neuroimmunologischen Aspekten.

So gibt es eine starke Wechselbeziehung zwischen Stress und Abwehrkraft. Man orientiert sich an der Anamnese genauso wie an verschiedenen Indizien, Symptomen und Laboruntersuchungen.

Klinisch liegt der Verdacht auf ein immunpathologisches Geschehen vor, wenn
 
     Anamnese und Befund auffällig sind (z.B. Hautbefunde wie Pyodermie , schwere Abszesse , Alopezie )

     Infektionen mit auffälliger Häufigkeit auftreten

     Erreger im Spiel sind, gegen die eigentlich ein Impfschutz vorliegen sollte

     Lymphatisches Gewebe reduziert ist (mangelnde Ausbildung / Reaktion von Lymphknoten, Fehlen von Tonsillen, Thymus,..)

     Ungewöhnliche (insbesondere opportunistische) Keime im Vordergrund stehen (die normalerweise nicht exazerbieren)

     Infektionen auffällig verlaufen (z.B. in den Nebenhöhlen, Mundsoor - Kandidose -, Osteomyelitiden usw.)

     Autoimmungeschehen auftreten
Eine fehlgelaufene Immunantwort muss noch keinen Immundefekt bedeuten. Liegt ein solcher tatsächlich vor, muss festgestellt werden, welche Komponente des Immunsystems betroffen ist. In diesem Fall ist die Anwendung spezieller Labordiagnostik angezeigt:

  Allgemein:
      Differenzialblutbild (Neutropenie? Lymphopenie?)

      Immunglobuline

      Komplementfaktoren (Komplementdefekt?)

      HLA-Typisierung

      In-vivo-Assays. Testungen auf Allergien s. dort

  Weiterführend:

      Phagozyten. Die Fähigkeit von Phagozyten, antigenbeladene Partikel (Latexkügelchen, Zellen, Bakterien) aufzunehmen, wird unter dem Mikroskop untersucht und spiegelt ihre Funktionstüchtigkeit wider.

      Proliferation mononukleärer Zellen: Lymphozyten, Monozyten oder dendritische Zellen werden isoliert und für 2-3 Tage in eine Gewebekultur verbracht. Dann wird ein Antigen (welchem die untersuchte Person möglicherweise ausgesetzt war) und seine Aufnahme durch die mononukleären Zellen bestimmt.

      T-Zell-System (In-vitro-Funktion, Immunphänotypisierung; T-Zell-Defekt?)

      B-Zell-System (in vivo, in vitro; humoraler Immundefekt?)

      Zytokine (z.B. IL-6 <11,3 ng/l, IL-8 <62 ng/l, TNF-α <8 ng/l)
  T-Lymphozyten
700-2200 /µl Blut
(CD4-Helferzellen 400-1500, CD8-Suppressorzellen 290-1100)

  B-Lymphozyten
80-450 /µl Blut

  NK-Zellen
100-640 /µl Blut
 
Labormethoden

Viele klinische Laboruntersuchungen beruhen auf der spezifischen Erkennung von in Lösung befindlichen Epitopen durch Antikörper (Agglutinationstests, Immundiffusionstest, Immunelektrophorese, Western blotting, Radioimmunoassay, ELISA, Fluoreszenz-Immunosorbent Assay). Epitope auf oder in Zellen können ebenfalls nachgewiesen werden (Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie). Schließlich lässt sich die Funktionstüchtigkeit isolierter Immunzellen testen (Phagozytose, Proliferation, Zytolyse).
 
Präzipitation / Agglutination Diffusion, Immunelektrophorese Immunoassays Immunfluoreszenz Durchflusszytometrie

 Präzipitation / Agglutination
 
Üblicherweise erfolgt die Quantifizierung eines in Lösung befindlichen Antigens über eine Präzipitationskurve, über die der "Antikörpertiter" gegen das in Frage stehende Antigen bestimmt werden kann ( Abbildung):
 

Abbildung: Bestimmung des Antikörpertiters
Modifiziert nach einer Vorlage in Doan / Lievano / Swanson-Mungerson / Viselli, Immunology (3rd ed). Lippincott Illustrated Reviews, Wolters Kluwer 2022
Vorbereitung: Erstellung einer Verdünnungsreihe. Blutserum (mit fraglichem Antikörper) der zu untersuchenden Person wird schrittweise verdünnt (1/2, 1/4, 1/8 etc). Dadurch nimmt die allfällige Antikörperkonzentration auf 50%, 25%, 12,5% etc. der (eventuellen) Konzentration des Antikörpers im Serum ab.
  
Antigen-Antikörper-Reaktion: Das interessierende Antigen (das multiple Epitope enthält) wird in immer gleicher Menge zu den Proben der Verdünnungsreihe zugegeben. Falls das Serum Antikörper enthält, entstehen Komplexe unterschiedlicher Ausprägung (je nach Antikörperkonzentration).
  
Reaktion mit gelösten Antigenen: Die Präzipitationskurve lässt drei Zonen erkennen: In der "Äquivalenzzone" (Mitte) erfolgt die stärkste Quervernetzung zwischen Antigen und Antikörper und infolge dessen intensive Präzipitation. Bei Antikörperüberschuss (geringe Serumverdünnung, links) finden zahlreiche Antikörpermoleküle kein Epitop zur Bindung, da bereits alle Epitope mit anderen Antikörpermolekülen besetzt sind. Bei Antigenüberschuss (rechts) ist es umgekehrt, in stark verdünnten Serumproben sind nur wenige Antikörper für eine Bindung verfügbar. Die Verdünnung, die gerade noch eine nachweisbare Präzipitation erzielt, wird als Antikörpertiter bezeichnet (z.B. 1:64).
  
Auch die Präzipitation von partikulären Antigenträgern (Zellen, Bakterien, Partikeln) hängt vom Verhältnis Antigen (konstant) / Antikörper (durch Verdünnung variabel) ab. Agglutination (Verklumpung) erfolgt bei mäßiger Serumverdünnung. In der "Prozone" (links) ist die Antikörperkonzentration für eine Agglutination zu hoch, bei hoher Serumverdünnung (rechts) zu niedrig, um Agglutinate auszubilden

Direkte Agglutinationsreaktionen werden durch IgM hervorgerufen - diese sternförmigen Immunglobuline mit 5 Ig-Armen können bis zu 10 Epitope an ein IgM-Molekül binden. Bindungsstellen an benachbarten Partikeln, z.B. Erythrozyten (Hämagglutination), können so miteinander verknüpft werden.

Soll die Anwesenheit von Antikörpern, die anderen Klassen als IgM angehören (z.B. IgG), im Patientenserum nachgewiesen werden, ergibt sich das Problem, dass diese meist keine brauchbare Agglutination der Antigenträger bewirken. Das kann auch gelten, wenn die Antikörperkonzentration im Serum sehr gering ist. In solchen Fällen wird das Prínzip der indirekten ("passiven") Agglutinationsreaktion genutzt ( Abbildung).
 

 Abbildung: Indirekte (passive) Agglutinationsreaktion
Nach einer Vorlage in Doan / Lievano / Swanson-Mungerson / Viselli, Immunology (3rd ed). Lippincott Illustrated Reviews, Wolters Kluwer 2022
Die Methode dient zur Verstärkung der Reaktion bei niedrigen Antikörperspiegeln oder zum Nachweis von IgG in Patientenserum.
 
Antigenträger (Zellen, Bakterien, Latexpartikel - "Antigen") werden mit einer Serumprobe der zu untersuchenden Person inkubiert (Mitte). Dieses enthält eventuell Antikörper, die gegen das interessierende Antigen gerichtet sind ("primärer" Antikörper).  Der Antikörper bindet zwar an "seine" Epitope, diese Reaktion ruft aber keine bzw. nur schwache Agglutination der Antigenträger hervor.
 
In einem zweiten Schritt (unten) werden "sekundäre" Antikörper (second-step antibodies, z.B. von Kaninchen) zugefügt. Diese erkennen und binden die primären Antikörper und vernetzen (agglutinieren) über sie die Antigenträger. Diese Reaktion ist deutlich nachweisbar

Indirekte Agglutinationsreaktionen können die Bindung spezifischer Antikörper (meist IgG) an die Antigenträger (z.B. Bakterien) nachweisbar machen oder auch Reaktionen mit primären Antikörpern verstärken, deren Effekt für einen klaren Nachweis nicht ausreichend ist.
 
Diffusionsmethoden
 
Epitope gelöster Antigene können u.a. mittels radialer Immundiffusion (Mancini-Test) nachgewiesen und quantifiziert werden. Serum mit einer definierten Konzentration von Antikörpern wird in ein flüssiges Agargel verbracht, wo es sich gleichmäßig verteilt. Dann wird das Gel abgekühlt und auf einen Träger (Glas oder Kunststoff) aufgebracht. In diesen flachen Gelblock wird ein Loch gestanzt, in das das Antigen verbracht wird.

Das Antigen diffundiert von hier in das Gel und reagiert mit dem (in ihm fixierten) Antikörper. Es resultiert ein Präzipitationsring, der mit der Zeit radial nach außen wandert. Schließlich bleibt der Ring stationär, und sein Durchmesser ist direkt proportional der Antigenkonzentration in der Probe.

Dies ist ein Beispiel für eine Einfachdiffusionstechnik, es diffundiert nur das Antigen oder der Antikörper, der jeweils andere Reaktionspartner ist im Gel fixiert (er bleibt stationär). Der Versuchsaufbau kann aber auch beide Komponenten (Antigen und Antikörper) gleichzeitig wandern lassen (Doppeldiffusion). Das kann zusätzlich mit einer Elektrophorese kombiniert werden:
 

Abbildung: Immunelektrophorese
Modifiziert nach einer Vorlage in Doan / Lievano / Swanson-Mungerson / Viselli, Immunology (3rd ed). Lippincott Illustrated Reviews, Wolters Kluwer 2022
Von oben nach unten ist der Ablauf dargestellt. In einen Agargelblock werden eine runde und eine längliche Vertiefung gestanzt. Dann wird ein Antigengemisch in die runde Vertiefung eingebracht und elektrophoretisch aufgetrennt. Antigene wandern entsprechend ihrer Ladung, Molekülgröße und -form zur Anode (links) bzw. Kathode (rechts). Nach Abschalten des Elektrophoresestroms beginnen sie, ringförmig in das Gel zu diffundieren.
 
Nun wird das Antiserum mit Antikörpern (die ein oder mehrere Epitope erkennen können) in die längliche Stanze eingebracht und diffundiert etwa linear den Antigengruppen entgegen. An den Orten, wo sie aufeinander treffen, entstehen Präzipitationsbögen 

Bei der Immunelektrophorese (IEP) handelt es sich um eine Erweiterung der Doppeldiffusionstechnik ( Abbildung). Ein Antigengemisch wird zuerst elektrophoretisch in mehrere Komponenten aufgetrennt, und die entstandenen Fraktionen diffundieren in der Folge gegen eine "Front" von Antikörpern.

Die entstehenden Präzipitationsbögen signalisieren jeweils eigene Antigene. Die Methode ist qualitativ (z.B. beantwortet sie die Frage, ob eine bestimmte Immunglobulinklasse im fraglichen Serum vorhanden ist oder nicht), lässt aber keine genaue Quantifizierung der Antigenfraktionen zu.

Eine weitere Methode zum Nachweis spezifischer Proteine ist das Immunoblotting (Western blotting, s. dort).
 
Quantitative Epitopnachweise: Immunoassays

Immunoassays (vgl. dort) zielen auf quantitative Antigenerkennung durch spezifische Antikörper ab. Antigene und Antikörper sind Bindungspartner (Liganden), die - in verschiedensten Testansätzen - mit Enzymen (Nachweis der Enzymwirkung), radioaktiven (Nachweis der radioaktiven Strahlung), fluoreszierenden (Nachweis der Lichtstrahlung) oder anderen Markern kombiniert werden. Das Ausmaß der enzymatischen oder Strahlungsaktivität kann dann als Hinweis auf die Konzentration des jeweiligen markierten Liganden im betreffenden Testansatz herangezogen werden.

       Radioimmunassay (RIA): Quantitativer Nachweis von Infektionsantigenen im Blut. Direkte (direct RIA) oder indirekte (indirect RIA) Antikörper (vgl. oben) können eingesetzt werden, wegen der Strahlenbelastung des Laborpersonals sowie unvermeidlichen Entsorgungsproblemen (radioaktiver Abfall) werden RIAs nur noch selten verwendet.


Festphasen-Enzym-Immunosorbent-Assays (EIA) bieten Alternativen zum klassischen RIA:
      Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Nachweis von Proteinen, z.B. Antikörpern, Viren. Dieser Test hat weitgehend Radioimmunoassays (RIA) ersetzt - er ist sicher, der Zeitaufwand für seine Durchführung gering, die Reagenzien sind relativ stabil und die Sensitivität übertrifft teilseise die eines RIA. ELISAs sind spezifisch und quantitativ.
 
Zur Durchführung eines ELISA werden Antigene in gelöster Form auf proteinabsorbierenden Polystyren-Platten (die 96 Vertiefungen aufweisen) aufgebracht. Antigen bindet an den Kunststoff, der Überstand wird abgewaschen, primäre Antikörper (oftmals im zu untersuchenden Serum) zugesetzt, ungebundene Antikörper abgewaschen. Dann werden enzymmarkierte Antikörper zugesetzt, die an die (gebundenen) primären Antikörper koppeln (der Überstand wiederum abgewaschen). Nun wird ein durch das Enzym spaltbares Chromogen (eine farblose oder nur schwach gefärbte Substanz, welche durch eine chemische Reaktion intensive Farbe annimmt) zugesetzt. Nach Inkubation zeigt der Farbwechsel den Grad der Anwesenheit sekundären Antikörpers - und indirekt die Menge an Epitop (an welches der primäre Antikörper gebunden hat) an.

       Ein Fluorescent immunosorbent Assay (FIA) verwendet fluoreszierende Marker (FITC: Fluorescein-Isothiocyanat, PE: Phycoerythrin). Diese leuchten kurz nach Anregung durch Licht auf (meist mit Photonen geringerer Energie als das der Anregung; als Fluorophor bezeichnet man ein System, das Fluoreszenz erkennen läßt; Fluorochrome bzw. Fluoreszenzfarbstoffe sind für Färbungen verwendete fluoreszierende Substanzen).
 
Einer der Liganden (Antigen oder Antikörper) wird auf eine Polystyrenoberfläche fixiert (immobilisiert), bevor der mit einem Fluorochrom markierte Bindungspartner zugesetzt wird. Je stärker die Bindung, desto intensiver die Fluoreszenz.
  
Epitoperkennung in oder auf Zellen
 
Mit Enzym, Fluorochrom oder radioaktiver Substanz markierte Antikörper werden auch zum Nachweis antigener Strukturen auf der Oberfläche (an die Außenmembran gebunden) oder im Inneren von Zellen verwendet. Besonders oft finden zwei der zahlreichen Methoden Verwendung: Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie.
 
Immunfluoreszenz
Immunfluoreszenz (IF) nützt fluoreszierende Marker (wie FITC), die kovalent an Antikörpermoleküle gebunden sind. Der Marker kann sich direkt auf dem primären Antikörper befinden, oder der unmakrierte spezifische Antikörper wird durch einen zweiten (mit Fluorochrom markierten) detektiert (indirekte Darstellung):
 

Abbildung: Immunfluoreszenz (IF)
Nach einer Vorlage in Doan / Lievano / Swanson-Mungerson / Viselli, Immunology (3rd ed). Lippincott Illustrated Reviews, Wolters Kluwer 2022
Ein auf einem Objektträger befindlicher Gewebeschnitt wird fluoreszenzmikroskopisch untersucht.

Links: Indirekte IF. Der Gewebeschnitt wird zuerst mit unmarkiertem Antikörper behandelt, der das nachzuweisende Epitop erkennt und an dieses bindet. Anschließend wird der Schnitt gewaschen (nicht gebundene Antikörper entfernt) und ein sekundärer (markierter) Antikörper (der an Antikörperepitope bindet) aufgebracht. Das Präparat wird inkubiert, dann wiederum gewaschen. An das Gewebe gebundene Antikörper leuchten bei fluoreszenzmikroskopischer Betrachtung auf.

Rechts: Direkte IF. Können die primären Antikörper direkt mit dem Fluorochrom markiert werden, entfällt die Notwendigkeit für einen zweiten Indikator-Antikörper

Gewebeschnitte werden in Antikörperlösung gebadet (FITC-markierte Antikörper bzw. primäre Antikörper, die anschließend mit sekundären markiert werden), gewaschen und die Intensität der Antigendetektion fluoreszenzmikroskopisch bestimmt.

Durchflusszytometrie
 
Als gut standardisierbare Untersuchungs- und Diagnosemethode wird die Durchflusszytometrie (flow cytometry) u.a. in der Immunologie eingesetzt. Dabei werden einzelne Zellen in einer Suspension (aufbereitete Blutprobe) an einer optischen oder elektrischen Detektionsstelle vorbeigeführt; die Detektionsrate liegt in der Größenordnung >103 Zellen pro Sekunde. Dabei treten Effekte auf, die von der Morphologie oder Färbung / Markierung der Zellen abhängen (Streulicht, Fluoreszenz) und von Detektoren erfasst werden.
 

Abbildung: Immunophenotyping
Nach Maecker HT et al, Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat Rev Immunol 2012; 12: 191-200
Beispiel eines durchflusszytometrischen Versuchsaufbaus. Kryokonservierung optional. Zellen werden mit Immunfluoreszenz markiert, der Detektor (Photomultiplier) auf optimale Empfindlichkeit eingestellt.
  
Jeder dieser Schritte kann zwischen verschiedenen Labors methodisch variieren, was die Ergebnisse bzw. Normwertbereiche beeinflusst

Größe und Strukturmerkmale (Komplexität) jeder Zelle bestimmt die Menge des detektierten Lichts. So weisen Granulozyten eine rauhe Oberfläche und zahlreiche Vesikel auf und streuen deshalb mehr Licht als T-Zellen mit ihrer glatten Oberfläche und weniger komplexen Strukturierung.

Das entstehende Vorwärtsstreulicht (FSC = Forward Scatter) und Seitwärtsstreulicht (SSC = Side Scatter) haben unterschiedliche Bedeutung ( Abbildung):

     FSC hängt vom Zellvolumen ab, da es mit der Lichtbeugung im flachen Winkel zusammenhängt.
 
     SSC hingegen ein Maß für das Licht, das im rechten Winkel abgelenkt wird und gibt Auskunft über die Granularität des Zytoplasma, die Zahl der Vesikel sowie Struktur und Größe des Zellkerns.
   

Abbildung: Durchflusszytometrische Karte von Leukozyten aus einer Blutprobe
Nach einer Vorlage in anth.ucsb.edu
Durch die Auffächerung nach zwei Kriterien der Durchflusszytometrie (Side scatter, Forward scatter) gelingt eine Zuordnung der Messpunkte auf verschiedene Zellgruppen (Granulo-, Mono-, Lymphozyten), vgl. dort

Zusätzlich zur Lichtstreuung können auch Fluoreszenzfarben erfasst werden ( Abbildung oben). Diese binden entweder direkt an bestimmte Zellbestandteile - so markieren 4,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) und Propidiumiodid DNA im Zellkern - oder man verwendet mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Antikörper, die meist Membranproteine erkennen.

Verwendet man verschiedenfarbige Laser / Filter, können mehrere Merkmale gleichzeitig quantifiziert werden.

Auf diese Weise kann z.B. eine CD-Klassifizierung (CD = cluster of differentiation) erfolgen. Man kennt mittlerweile über 300 CD-Merkmale. Diese werden spezifisch von bestimmten Zellen exprimiert und haben unterschiedliche Funktionen. Die Analyse der Ausprägung diverser zellulärer Oberflächenmerkmale wird als Immunophenotyping bezeichnet.
           Externer Link: Liste von CD-Markern

Die Durchflusszytometrie erlaubt durch computergesteuerte elektrische Aufladung der aus der vibrierenden Düse fallenden, jeweils eine definierte Zelle enthaltenden Tröpfchen die Separierung verschiedener Zellpopulationen aus einer Blutprobe. Negativ aufgeladene Tröpfchen werden Richtung Anode, positiv aufgeladene Richtung Kathode abgelenkt. So können beispielsweise CD4+-Zellen und CD8+-Zellen in getrennte Behälter aufgefangen und als definierte Zellpopulation weiter untersucht bzw. verwendet werden.
  
 Nachweis zellulärer Immunfunktionen
 
Die Evaluierung von Komponenten der zellulären Immunfunktionen (CMI: Cell-mediated immunity) ist ein wesentlicher Bestandteil der Beurteilung des immunologischen Abwehrpotenzials. Insbesondere kann das Risiko einer Immunotoxizität durch z.B. CD8-positive Lymphozyten ermittelt werden (CTL-Assay).

Wie kann man die Funktionstüchtigkeit einzelner Immunzellen unter kontrollierten Bedingungen untersuchen und quantifizieren? In vivo ist das kaum möglich, insbesondere, wenn definierte Versuchsbedingungen vorliegen sollen. Aus Blut lassen sich Immunzellen leicht gewinnen, aber es enthält ein breites Spektrum verschiedener Leukozyten, die man für in-vitro-Untersuchungen in separater Form benötigt.

Die Anwendung durchflusszytometrischer Verfahren erlaubt es, Leukozyten separat aus einer Blutprobe zu gewinnen und dann zu untersuchen. Die Funktionstüchtigkeit solcher definierter Immunzellen kann dann auf verschiedene Weise getestet werden: Wie steht es um die Fähigkeit von Phagozyten, mit Antigen oder Opsonin bedeckte Partikel aufzunehmen? Wie intensiv sprechen Lymphozyten auf mitogene oder auf spezifische Antigenreize an? Reagieren zytotoxische Zellen auf spezifische pMHC-Reize mit Abtötung der Zielzellen?
 
  Phagozytenfunktion
 

Abbildung: Prüfung der Phagozytenfunktion
Nach einer Vorlage in Doan / Lievano / Swanson-Mungerson / Viselli, Immunology (3rd ed). Lippincott Illustrated Reviews, Wolters Kluwer 2022
Optisch darstellbare, mit Opsoninen (Antigen oder Antikörper) bedeckte Partikel (1: Zellen, Bakterien, Latexpartikel) werden mit Phagozyten (2) inkubiert. Die Leukozyten phagozytieren einen Teil der Partikel (3). Die Auswertung (4) erfolgt mit dem Mikroskop

Wie fit sind phagozytosefähige Leukozyten (Monozyten, neutrophile Granulozyten..) in der Blutprobe einer Person, deren Immunfunktionen untersucht werden sollen? Um dies zu testen, wird eine Gruppe Leukozyten mit Korpuskeln (z.B. Latexpartikeln, Bakterien, Erythrozyten) inkubiert, deren Oberfläche mit Opsoninen (die Phagozytose anregenden Stoffen) bedeckt ist.

Anschließend kann man die Intensität der Phagozytose mikroskopisch beurteilen ( Abbildung) oder die Aktivität von Enzymen messen, welche die mit den Partikeln konfrontierten Zellen produzieren.

  Proliferation von Lymphozyten, Monozyten, dendritischen Zellen
   

Abbildung: Proliferationsassay
Nach einer Vorlage in Doan / Lievano / Swanson-Mungerson / Viselli, Immunology (3rd ed). Lippincott Illustrated Reviews, Wolters Kluwer 2022
Dieser Versuchsansatz testet die Reaktionsfähigkeit mononukleärer Blutzellen auf einen Antigen- oder Mitogenreiz (1), der einer Zellkultur angeboten wird. Es folgt eine Inkubation für 24-72 Stunden Dauer (2). Anschließend wird ein markierter Nukleinsäure-Vorläufer zugegeben (3), z.B. Tritium-Thymidin (3H-TdR). Tritium ist ein Radionuklid, es emittiert Elektronen (ß-Strahlung).
 
Nach weiteren 18-24 Stunden Inkubation (4) ist der Marker in frisch aufgebaute DNA eingebaut, und die Radioaktivität ist ein Maß für die erfolgte Proliferation (5).
Man kann auch untersuchen, wie mononukleäre Zellen sich teilen, wenn sie entsprechend dazu angeregt werden. Für einen solchen Proliferationstest werden Lymphozyten, Monozyten oder dendritische Zellen aus eine Blutprobe isoliert (Zellsortierung s. oben) und für 2-3 Tage in eine Zellkultur verbracht. Ein nichtspezifisches Mitogen wird zugesetzt, oder ein Antigen, gegen das die Person (von der die Blutprobe stammt) sensibilisiert sein könnte.

Zur Darstellung können fluoreszierende Marker verwendet werden, wie Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CSFE), ein Stoff, der durch Zellmembranen in das Zellinnere gelangt, sich kovalent an intrazelluläre Moleküle bindet (hier stabil verbleibt) und nicht auf Nachbarzellen verteilt. (CSFE kann auch dazu verwendet werden, den Weg markierter Lymphozyten durch den Organismus über Monate zu verfolgen.)

Teilen sich die Zellen, wird dieser Marker je Zelle "verdünnt" (pro Mitose jeweils auf die Hälfte), indem er auf die Tochterzellen aufgeteilt wird. Auf diese Weise kann man 7-8 Mitosen nachweisen, bevor durch die Verdünnung des Markes die für den Nachweis notwendige Aktivität zu gering geworden ist.

  Zytotoxischer T-Zellen- Assay

Abbildung: Chrom-Freisetzungsassay
Nach einer Vorlage in Doan / Lievano / Swanson-Mungerson / Viselli, Immunology (3rd ed). Lippincott Illustrated Reviews, Wolters Kluwer 2022
Mit diesem Test kann die Funktion zytotoxischer T-Zellen (CTL), natürlicher Killerzellen (NK) und NKT-Zellen untersucht werden.
 
Die Zielzellen werden mit einem radioaktiven Schwermetall inkubiert (1), das an Proteine im Zytoplasma bindet (2 - Radioaktivität in Zellen rot angedeutet). Testzellen (=Effektorzellen) werden mit den markierten Zellen mit verschiedenem Zahlenverhältnis Effektorzellen / Zielzellen inkubiert (3).
 
Wenn vorhanden, lysieren CTL, NK oder NKT-Zellen die Zielzellen, was Radioaktivität in das Medium freisetzt (4). Anschließend wird die Radioaktivität im (zellfreien) Medium - hier als rote Flüssigkeit dargestellt - gemessen (5)

CD8-positive Lymphozyten (Killerzellen) lysieren ihre Zielzellen (Zellen, die entsprechende Fremdepitope über ihre MHC-I-Moleküle präsentieren). Ihre Aktivität kommt im klassischen Versuchsaufbau ( Abbildung) im Ausmaß der Radioaktivität zum Ausdruck, die nach der Freisetzung des markierten Zytosols aus den lysierten Zellen in der Flüssigkeit des Inkubationsmediums nachweisbar wird.

Neuere Methoden nutzen das Apoptosesystem (Caspase-3-Spaltprodukte werden durch Antikörper erkannt) und Immunfluoreszenz. Auch auf diese Weise kann man die lytische Aktivität von CD8+-, natürlichen Killer- sowie von NKT-Zellen ermitteln.
 

 
     Verdacht auf immunpathologische Abweichungen besteht bei auffälliger Anamnese, häufig auftretenden Infekten, schwachem Impfschutz, reduziertem lymphatischen Status, ungewöhnlichen Infekten,  Autoimmungeschehen
 
      Immunkompetenz läßt sich anhand vielfacher Indikatoren abschätzen: Differenzialblutbild, Komplementfaktoren, HLA, zelluläre / humorale lymphatische Funktionen, Zytokinstatus
 
      Spezifische Erkennung von in Lösung befindlichen Epitopen erfolgt durch Antikörper (Agglutinationstests, Immundiffusionstest, Immunelektrophorese, Western blotting, Radioimmunoassay, ELISA, Fluoreszenz-Immunosorbent Assay). Immunoassays umfassen Radioimmunoassay (RIA), Festphasen-Enzym-Immunosorbent-Assays (EIA), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
 
      Epitope auf oder in Zellen werden z.B. durch Immunfluoreszenz oder Durchflusszytometrie erfasst.
Die Funktionstüchtigkeit isolierter Immunzellen kann über die Intensität der Phagozytose, Proliferation, oder Zytolyse bestimmt werden
 
      Durchflusszytometrie erfasst Charakteristika einzelner Zellen über optische oder elektrische Detektion; die Signale korrelieren mit Größe und Strukturmerkmalen der Zellen: Beispielsweise Vorwärtsstreulicht (FSC = Forward Scatter) mit dem Zellvolumen, Seitwärtsstreulicht (SSC = Side Scatter) mit der Granularität des Zytoplasma, der Zahl der Vesikel, Struktur und Größe des Zellkerns
 
     Auch CD-Klassifizierungen sind mit solchen Methoden möglich (Immunophenotyping)
 

 




  Die Informationen in dieser Website basieren auf verschiedenen Quellen: Lehrbüchern, Reviews, Originalarbeiten u.a. Sie sollen zur Auseinandersetzung mit physiologischen Fragen, Problemen und Erkenntnissen anregen. Soferne Referenzbereiche angegeben sind, dienen diese zur Orientierung; die Grenzen sind aus biologischen, messmethodischen und statistischen Gründen nicht absolut. Wissenschaft fragt, vermutet und interpretiert; sie ist offen, dynamisch und evolutiv. Sie strebt nach Erkenntnis, erhebt aber nicht den Anspruch, im Besitz der "Wahrheit" zu sein.