Albumin: albus = weiß (Eiweiß)
Elektrophorese: ἤλεκτρον = Bernstein, φορος = tragend
Globulin: kugelförmiges Eiweiß, globus = Kugel
Granulozyt: granulum = Körnchen, κύτος = Höhlung, Gefäß (Zelle)
Labormedizin: labor = Arbeit, medicus = Arzt
-phil: φίλος = Freund
Zytokin: κύτος = Zelle, κίνησις = Bewegung
Labordiagnostische
Untersuchungen werden meist an Körperflüssigkeiten oder auch Zellsuspensionen
vorgenommen. Das am häufigsten verwendete Untersuchungsgut ist Blut
bzw. Blutserum,
da es eine Fülle von Informationen über den aktuellen Zustand von Zellen,
Geweben und Organen mit sich trägt (Elektrolyte, Hormone, Substrate,
Enzyme,
Gerinnungsfaktoren, Zellen und Produkte des Immunsystems,
Metabolite..). Blutproben
erlauben die Bestimmung von "Blutbildern"
("rot": Erythrozyten, Hämoglobingehalt, Hämatokrit; "weiß": Leukozyten,
Thrombozyten)
und geben so Aufschluss über Blutgastransport, Immunsituation und
Plättchenstatus. Im Plasma können u.a. Konzentrationswerte vieler
verschiedener Proteine ermittelt werden (Albumin, Globuline), was
Rückschlüsse auf den Zustand von Leber, Nieren,
Abwehrsystem und vieles andere erlaubt.
Harnproben
geben Aufschluss über die renale Ausscheidungs- und
Rückresorptionsleistung (Nierenfunktion) sowie über Tätigkeit bzw. Größe von Organen
und Geweben, die ausscheidungsfähige Metabolite in den Kreislauf
abgeben (z.B. Kreatinin aus der Muskulatur).
Auch die
Analyse von Speichel, Schweiß, Tränenflüssigkeit, Liquor
cerebrospinalis, Magensaft, Pankreas- und Gallesekret sowie
Zervixsekret liefert diagnostisch aufschlußreiche Informationen.
|
Untersuchungsgut 
Messungen an Blutproben Elektrophorese Verwendung von Antikörpern
Physiologische Aspekte der Labordiagnostik
Erkennung von Krankheiten berücksichtigt sehr
unterschiedliche Aspekte: Was ist als physiologisch
anzusehen, was ist ein Zeichen einer Erkrankung? Wie verlässlich
sind die gesammelten Hinweise? Wie sammelt man sinnvoll und korrekt
Proben für klinisch-chemische Untersuchungen, welche Möglichkeiten der
Verfälschung sind zu berücksichtigen?
Abbildung: Klinisch-chemisches Labor
Quelle: www.ce-tech.com
Probensubstanzen
sind z.B. Blut und seine Komponenten (Blutkörperchen, Blutserum), Harn,
Liquor cerebrospinalis u.a. Zum Einsatz kommen Methoden aus der
anorganischen Chemie sowie Elektrochemie (z.B. Elektrolyte), Biochemie (z.B.Kohlenhydrate, Lipide,
Proteine), Molekularbiologie (z.B. Erbsubstanz).
Proben werden automatisch gekennzeichnet (Barcode), um Verwechslungen zu vermeiden.
Fehler können schon vor der eigentlichen Messung erfolgen: Bei Probenabnahme
(Hämolyse, Tageszeit, Körperlage, Stauung...), Aufbewahrung und Transport (z.B.
Temperatur, enzymatische Veränderung, Blutsenkung)
Labor(atoriums)medizin ist die wissenschaftlich-diagnostische Beschäftigung mit
Blut
(~7% des Körpergewichts, isoton, spiegelt den Zustand praktisch aller
Organe / Gewebe wider, deren Zellen Stoffe in den Extrazellulärraum und
in den Kreislauf abgeben - bei Beschädigungen der Zellmembran teilweise
organspezifische Substanzen, z.B. Enzyme, deren Konzentration im Blut
diagnostisch aufschlussreich ist) - Blutplasma - Blutserum,
Harn
(Produkt der Nierenfunktion: Ausscheidungs- und
Rückresorptionsleistung, Menge - normalerweise 1-2 l/d - und
Osmolalität variieren stark mit Wasserbelastung, vegetativem und
Hormonstatus) und anderen Flüssigkeitsproben:
Speichel
(~1 l/d, Produkt der Parotis-, Sublingual- und Submandibulardrüsen,
die unterschiedliche Mengen unterschiedlich zusammengesetzten,
hypotonen Sekrets produzieren),
Schweiß
(dient primär der Kühlung durch Evaporation; bis mehrere l/d;
normalerweise hypoton (niedriger Salzgehalt), Menge und Zusammensetzung
physiologisch / medizinisch / diagnostisch bedeutsam),
Tränenflüssigkeit (schützt Auge und Tränenwege, isoton, daher salzreich, enthält spezifische Schutzfaktoren),
Liquor (Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, ~150 ml, isoton, Polsterungs- und chemische Stabilisierungsfunktion),
Zervixsekret (Menge und Konsistenz zyklusabhängig),
Verdauungssäfte (diagnostisch besonders bedeutsam Magensaft, Pankreas- und Gallesekret), u.a.
All
diesen Flüssigkeiten kommen spezifische physiologische Aufgaben und
Eigenschaften zu, und ihre Analyse gibt Aufschluss über die Funktion von
Zellen, Geweben und Organen, die sich an ihrer Bildung (z.B. Leber),
Veränderung und Entfernung (z.B. Nieren) beteiligen.
Messungen an Blutproben
Blut
befördert Stoffe teils frei gelöst (wie Sauerstoff, Kohlendioxid,
Stickstoff, Salze, Glucose, Harnstoff, Aminosäuren, Proteine), teils an
Protein gebunden (Fette, Schilddrüsen- und Steroidhormone);
Informationsstoffe (Hormone, Wachstumsfaktoren). Auch transportiert Blut Wärmeenergie, die
über Haut und Schleimhäute an die Außenwelt abgegeben wird.
Abbildung: Die Körperlage beeinflusst die Zusammensetzung des Blutes
Photo © iap
Versuchsperson am Kipptisch in Kopf-Tieflage, Abnahme einer Blutprobe aus Kubitalvene.
Im Vergleich zu aufrechter Körperlage (Sitzen, Stehen) nimmt die
Konzentration vieler Blutkomponenten in liegender Position ab (Hämatokrit,
Eiweißkonzentration), da es in den unteren Körperpartien zu Verlagerung
von Gewebsflüssigkeit in die Blutbahn und damit Hämodilution kommt (vgl. dort).
Das
Blutvolumen nimmt bei Wechsel von aufrechter zu liegender Körperposition innerhalb von Minuten um ~10% zu
Einzelne Proteine werden mittels
Antikörpern bestimmt, die spezifisch mit ihnen reagieren (Immunoassay).
Weniger spezifisch ist die Elektrophorese:
Albumin 
macht 60% der Plasmaeiweiße aus
und besteht aus einer einheitlichen Molekülart. Es bewirkt 90% des
kolloidosmotischen Effekts, ist ein Reserveeiweiß, und transportiert
u.a. das Schilddrüsenhormon Thyroxin. Die Albuminkonzentration im
Blutplasma beträgt 40-50 g/l.
Globuline sind vielfältig in molekularer Form und Funktion: Gerinnungsfaktoren, Antikörper,
Komplementfaktoren, spezifische Transportproteine. Die
Globulinkonzentration im Blutplasma beträgt 20-30 g/l.
Abbildung: Bestimmung von Hämoglobingehalt, Zellzahlen und Zelltypen
Nach verschiedenen Vorlagen kompiliert
Bei
automatisierten Blutanalysen werden Blutkörperchen aus einer verdünnten
Blutprobe durch eine Messschranke geleitet.
Dort verursachen sie Impedanzschwankungen, deren Größe mit dem
Zellvolumen korreliert. Auf diese Weise können Erythrozyten- (~5 Mio /
µl) und Thrombozytenzahlen (~0,3 Mio / µl) ermittelt werden.
Bei der automatiischen Analyse weißer Blutkörperchen (~5 Tausend / µl)
kommt die Flusszytometrie zum Einsatz. Dabei werden die Impulse nach
Zellvolumen und Granularität des Zellinhaltes zweidimensional
"aufgespreizt" und mit hoher Treffsicherheit in Felder zugeordnet, die
für die einzelnen Zelltypen definiert wurden (Monozyten,
Polymorphkernige, Eosinophile, Lymphozyten).
MCV, mean corpuscular volume
PMN = polymorphkernige Leukozyten (Graulozyten)
Vgl. dort
Zu physiologischen Faktoren, welche die Messwerte beeinflussen
können, gehören Art der Probe (z.B. arterielles vs. venöses Blut), Alter und Geschlecht, Tageszeit (z.B. unterschiedliche Hormonausschüttung mit zirkadianen Rhythmen), Lagerung des Körpers (liegend, aufrecht), Muskelaktivität u.a.
Blutbildung: Blutkörperchen werden im roten Knochenmark nachgebildet, Lymphozyten in
lymphatischen Geweben. Ihre Vorstufen sind in Präparaten von
Knochenmarkpunktat zu finden. Zytokine regulieren Differenzierung, Teilung und Reifung der Zellen zu Erythro-,
Leuko- und Thrombozyten.
Im Gegensatz zu Erythrozyten und Thrombozyten, die vollzählig in der
Blutbahn bleiben, befinden sich nur 5% der Granulozyten und 2% der
Lymphozyten im Blut - der Großteil des “Leukozytenpools” hält sich im
Gewebe auf.
Auch unterscheiden sich die Blutkörperchen in ihrer
Lebensdauer:
Erythrozyten 3 bis 4 Monate
Thrombozyten und Granulozyten
1-2 Wochen
Kurzlebige Lymphozyten 5-10 Tage, langlebige vermutlich
mehrere Jahre.
Daraus folgt, dass Leukozyten und Thrombozyten viel
schneller nachgebildet werden als Erythrozyten. Daher findet man im
roten Knochenmark auch vor allem Myelozyten (Vorstufen weißer
Blutkörperchen) und wenig Erythroblasten (Vorstufen roter
Blutkörperchen).
Die Zahl der Blutkörperchen ist, wie die Aufrechterhaltung von
Stoffkonzentrationen im Blut, ein Resultat eines Fließgleichgewichts
zwischen Abbau und Neubildung.
In der Mitte ein segmentkerniger neutrophiler Granulozyt. Das Zahlenverhältnis zu Erythrozyten beträgt ungefähr 1 : 1700
Da sich Leukozyten hauptsächlich
außerhalb der Blutbahn aufhalten (Granulozyten zu 95%, Lymphozyten zu
98%), kann eine Umverteilung zwischen intra- und extravasalen bzw.
kapillär fixierten Leukozyten ebenfalls Änderungen der Leukozytenzahlen
im strömenden Blut bedingen.
Zum roten und weißen Blutbild s. dort
Aus Blutproben lassen sich zahlreiche Rückschlüsse auf Organfunktionen ziehen:
Enzymkonzentrationen spiegeln eventuelle Störungen an Zellen wider, diese sind z.T. organspezifisch (Niere, Herzmuskel, Leber u.a.)
Verschiedene Marker werden verwendet, um diagnostisch wichtige
Kenngrößen wie z.B. Herzminutenvolumen (Indikatordurchgang),
glomeruläre Filtration (Inulinclearance), Nierendurchblutung
(PAH-Clearance) usw. zu quantifizieren.
Elektrophorese
Das
Prinzip der elektrophoretischen Auftrennung einer Probe besteht darin,
elektrisch geladene, frei bewegliche Teilchen (z.B. Proteinmoleküle,
Nukleinsäuremoleküle) in einem elektrischen Gleichstromfeld wandern zu
lassen - Kationen zur Anode, Anionen zur Kathode. Ziel ist die
Auftrennung des Molekülgemisches in mehrere Fraktionen, die
anschließend optisch dargestellt (gefärbt) und photometrisch
quantifiziert werden können. Um die Ladungen an den Molekülen während
dieses Vorgangs möglichst stabil zu halten, wird das Medium (in dem die
Bestandteile der Probe wandern) mit einer Pufferlösung getränkt.
Verwendung von Antikörpern
Immunoassays: Zahlreiche klinisch-diagnostische Labormethoden beruhen auf der Verwendung von Antikörpern,
das sind Proteine mit hoher Bindungsspezifität. Sie erkennen Antigene
und werden zu ihrer Detektion, Reinigung und/oder Quantifizierung
verwendet. Antikörper können zum Nachweis praktisch jeden beliebigen
Makromoleküls produziert werden.
Abbildung: Radioimmunoassay
Nach einer Vorlage in Abbas / Lichtman / Pillai: Cellular and Molecular Immunology, 9th ed. 2018
Ein sandwich enzyme-linked immunosorbent assay.
Eine definierte Menge immobilisierten Antikörpers wird zur Bindung des
Antigens auf die Mikrotiterplatte fixiert (1). Damit wird das Antigen
gebunden (2) und ein mittels eines anderen, markierten (rote Sternchen)
Antikörpers ein anderes Epitop (damit es bei der Bindung nicht zu
gegenseitiger Behinderung kommt) am Antigen gebunden (4).
Um nur
gebundene Marker zu messen, werden überschüssige Antikörper
abgewaschen (5); erst dann erfolgt die Messung (Radioaktivität,
Farbreaktion etc).
Wird das Verfahren mit einer Konzentrationsreihe eines Antigens
wiederholt, lässt sich eine Eichkurve (Standardkurve) ermitteln (6),
anhand derer dann eine unbekannte Menge Antigen in einer fraglichen
Bioprobe über den entsprechenden Markerwert der Standardkurve
quantifiziert wird
Besonders treffsicher und
reproduzierbar arbeitet man mit monoklonalen Antikörpern, d.h. solchen,
die aus einem identen Lymphozytenklon stammen und daher exakt die gleiche
Bindungsspezifität zu bestimmten Epitopen auf zu erkennenden Antigenen haben.
So
können ganz bestimmte Bindungsmerkmale (Epitope) an (antigenen)
Molekülen reproduzierbar dargestellt werden - in oder auf Zellen, im
Gewebe, in Gelen oder in Lösung.
In letzterem Fall werden entweder
Antikörper oder Antigene auf Trägeroberflächen fixiert
(Abbildungen)
und mit dem in Lösung befindlichen Partner zur Reaktion gebracht. Da
die Antigen-Antikörper-Reaktion an sich unsichtbar bleibt, wird eine
Zusatzreaktion für die Indikation benötigt (Farbstoff, Enzym mit
sichtbarer Folgereaktion, radioaktiver Stoff).
Bei diesem
"Sandwich"-Verfahren spricht man im Fall der Verwendung eines Enzyms
von ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), bei Verwendung eines radioaktiven Markers von RIA (Radioimmunoassay).
Abbildung: "Antigen-Sandwich" ELISA
Nach
Yucel F, Akcael E. Development of sandwich ELISA systems for the
diagnosis of hepatitis B virus surface antigen and its antibody in
human sera. J Microbiol Exp. 2018; 6: 77–8
Zuerst wird Antikörper gegen das nachzuweisende Antigen an eine Mikrotiterplatte aus Plastik (Festphase,
microwell) gebunden (
links).
Dann werden (verschiedene Mengen von) Antigen zugesetzt und nicht
gebundenes Antigen weggewaschen. Anschließend wird der
Detektions-Antikörper zugesetzt (er erkennt ein
anderes Epitop am Antigen
als der erste Antikörper, die beiden Bindungen dürfen nicht interferieren).
An den Detektions-Antikörper ist ein Enzym
gebunden. Nach abermaligem Waschen wird Substrat zugesetzt, die
Umsetzung durch das Enzym ist proportional zur gebundenen Menge an
Antigen.
Bei jeder Messung entsteht eine bestimmte Signalgröße (Fluorophore, Chemoluminiszenz). Durch
Bestimmung der Signalgröße bei verschiedenen bekannten
Antigenkonzentrationen ermitttelt man eine
Standardkurve, anhand derer dann das Signal bei unbekannter Antigenmenge einer bestimmten Konzentration zugeordnet werden kann
Die ermittelte sigmoidale Standardkurve
stellt die Beziehung zwischen Konzentration des zu quantifizierenden
Bindungspartners (Antigen oder Antikörper) und der Signalstärke
(Farbintensität - Spektrophotometer, Radioaktivität - Counter) dar.
Abbildung: "Antikörper-Sandwich" ELISA
Nach
Yucel F, Akcael E. Development of sandwich ELISA systems for the
diagnosis of hepatitis B virus surface antigen and its antibody in
human sera. J Microbiol Exp. 2018; 6: 77–8
In diesem Fall wird Antigen an die
Festphase gebunden. Verschiedene Seren mit bekannter
Antikörperkonzentration werden aufgebracht, der Überstand jeweils
weggespült und die Intensität des Messsignals registriert. Daraus wird
eine Standardkurve erstellt.
Das Prinzip ist ähnlich wie beim "Antigen-Sandwich": Anhand der
Standardkurve kann die (unbekannte) Konzentration des betreffenden Antikörpers in
Testseren quantifiziert werden.
Wenn
statt eines Enzyms ein stabil strahlendes Isotop an den (Detektions-)
Antikörper gebunden wurde, misst man die Radioaktivität
Es gibt zahlreiche weitere Verfahren, die auf dem Prinzip der
(quantifizierbaren) Antigen-Antikörper-Bindung beruhen:
Immunoblotting: Beim Western Blotting (blot = Klecks, Fleck) wird ein Proteingemisch (Körperflüssigkeiten bzw. Zellhomogenate) durch Gelelektrophorese (typischerweise SDS-PAGE) nach Molekülgröße aufgetrennt und die entstandenen "Blots" werden vom Polyacrylamidgel auf Mikrozellulose
übertragen (fixiert). Antikörper binden
an ihre Zielproteine, die so identifiziert, quantifiziert und
gegebenenfalls separiert werden können. Das Verfahren kann verfeinert
werden, indem ein Zwischenschritt mit Immunpräzipitation eingeschaltet
wird.
Mehr zum
Western-blot s.
dort
Abbildung: Immunpräzipitation (oben) und Affinitätschromatographie (unten)
Nach einer Vorlage in Abbas / Lichtman / Pillai: Cellular and Molecular Immunology, 9th ed. 2018
Oben: Immunpräzipitation.
Die Methode dient zur Identifikation, Reinigung und Quantifizierung
eines Antigens. Aus einer Mischung verschiedener Antigene (in Serum
oder anderen Flüssigkeiten) wird das gesuchte durch Bindung an den
spezifischen Antikörper selektiert und anschließend separiert.
Unten: Affinitätschromatographie.
Die Methode wird oft zur Isolierung löslicher Antigene aus einem
Antigenmix verwendet (wie im Bild gezeigt). Ziel ist die Gewinnung
reinen Antigens
Immunpräzipitation ( Abbildung):
Einem Antigengemisch wird im Überschuss immobilisierter (an Kügelchen
gebundener) Antikörper zugesetzt, der das Antigen bindet und aus dem
Gemisch durch Zentrifugieren separiert wird.
Durch Änderung des pH-Werts oder der Ionenstärke der Lösung wird das
Antigen von der Antikörperbindung befreit und in reiner Form
dargestellt, z.B. mittels Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
Affinitätschromatographie
( Abbildung): Das Prinzip ist das gleiche - wie identifiziert
und isoliert man ein gesuchtes Antigen? Die für das darzustellende
Antigen spezifischen Antikörper sind an eine unlösliche Phase
(unlösliche Kügelchen, oder Matrix
der Chromatographiesäule) gebunden. Auch hier wird nach Zugabe der
fraglichen Flüssigkeit (z.B. Serum) ungebundenes Antigen weggewaschen
und schließlich das gereinigte Antigen gewonnen.
Durchflusszytometrie
(Fluorescence-activated cell sorting, FACS) s. dort
Die Informationen in dieser Website basieren auf verschiedenen Quellen:
Lehrbüchern, Reviews, Originalarbeiten u.a. Sie
sollen zur Auseinandersetzung mit physiologischen Fragen, Problemen und
Erkenntnissen anregen. Soferne Referenzbereiche angegeben sind, dienen diese zur Orientierung; die Grenzen sind aus biologischen, messmethodischen und statistischen Gründen nicht absolut. Wissenschaft fragt, vermutet und interpretiert; sie ist offen, dynamisch und evolutiv. Sie strebt nach Erkenntnis, erhebt aber nicht den Anspruch, im Besitz der "Wahrheit" zu sein.
Labormedizinische Bestimmungsmethoden
Je größer die elektrische Feldstärke (gemessen in V/cm), desto intensiver die Bewegung der Teilchen. Diese hängt noch von anderen Faktoren ab:
