Eine Reise durch die Physiologie - Wie der Körper des Menschen funktioniert
 

    
Grundlagen und Methoden der Physiologie; molekulare und zelluläre Aspekte
 
Labormedizinische Bestimmungsmethoden
© H. Hinghofer-Szalkay
Albumin: albus = weiß (Eiweiß)
Elektrophorese: ἤλεκτρον = Bernstein, φορος = tragend
Globulin: kugelförmiges Eiweiß, globus = Kugel
Granulozyt: granulum = Körnchen,
κύτος = Höhlung, Gefäß (Zelle)
Labormedizin: labor = Arbeit, medicus = Arzt
-phil: φίλος = Freund
Zytokin:
κύτος = Zelle, κίνησις = Bewegung


Labordiagnostische Untersuchungen werden meist an Körperflüssigkeiten oder auch Zellsuspensionen vorgenommen. Das am häufigsten verwendete Untersuchungsgut ist Blut bzw. Blutserum, da es eine Fülle von Information über den aktuellen Zustand von Zellen, Geweben und Organen mit sich trägt (Elektrolyte, Hormone, Substrate, Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Zellen und Produkte des Immunsystems, Metabolite..). Blutproben erlauben die Bestimmung von "Blutbildern" ("rot": Erythrozyten, Hämoglobingehalt, Hämatokrit; "weiß": Leukozyten, Thrombozyten) und geben so Aufschluss über Blutgastransport, Immunsituation und Plättchenstatus. Im Plasma können u.a. Konzentrationswerte vieler verschiedener Proteine ermittelt werden (Albumin, Globuline), was Rückschlüsse auf den Zustand von Leber, Nieren, Abwehrsystem und vieles andere erlaubt.

Harnproben geben Aufschluss über die renale Ausscheidungs- und Rückresorptionsleistung (Nierenfunktion) sowie über Tätigkeit bzw. Größe von Organen und Geweben, die ausscheidungsfähige Metabolite in den Kreislauf abgeben (z.B. Kreatinin aus der Muskulatur).

Auch die Analyse von Speichel, Schweiß, Tränenflüssigkeit, Liquor cerebrospinalis, Magensaft, Pankreas- und Gallesekret sowie Zervixsekret liefert diagnostisch aufschlußreiche Information.



Untersuchungsgut Messungen an Blutproben  Verwendung von Antikörpern
 
Physiologische Aspekte der Labordiagnostik

Erkennung von Krankheiten berücksichtigt sehr unterschiedliche Aspekte: Was ist als physiologisch anzusehen, was ist ein Zeichen einer Erkrankung? Wie verlässlich sind die gesammelten Hinweise? Wie sammelt man sinnvoll und korrekt Proben für klinisch-chemische Untersuchungen, welche Möglichkeiten der Verfälschung sind zu berücksichtigen?
 

>Abbildung: Klinisch-chemisches Labor
Quelle: www.ce-tech.com

Probensubstanzen sind z.B. Blut und seine Komponenten (Blutkörperchen, Blutserum), Harn, Liquor cerebrospinalis u.a. Zum Einsazu kommen Methoden aus der anorganischen (z.B. Elektrolyte), Biochemie (z.B.Kohlenhydrate, Lipide, Proteine), Molekularbiologie (z.B. Erbsubstanz).
 
Proben werden automatisch gekennzeichnet (Barcode), um Verwechslungen zu vermeiden.
 
Fehler können schon vor der eigentlichen Messung erfolgen: Bei Probenabnahme (Hämolyse, Tageszeit, Körperlage, Stauung...), Aufbewahrung und Transport (z.B. Temperatur, enzymatische Veränderung, Blutsenkung)


Untersuchungsgut
 

Labor(atoriums)medizin ist die wissenschaftlich-diagnostische Beschäftigung mit

  
  Blut (~7% des Körpergewichts, isoton, spiegelt den Zustand praktisch aller Organe / Gewebe wider, deren Zellen Stoffe in den Extrazellulärraum und in den Kreislauf abgeben - bei Beschädigungen der Zellmembran teilweise organspezifische Substanzen, z.B. Enzyme, deren Konzentration im Blut diagnostisch aufschlussreich ist) - Blutplasma - Blutserum,

     Harn (Produkt der Nierenfunktion: Ausscheidungs- und Rückresorptionsleistung, Menge - normalerweise 1-2 l/d - und Osmolalität variieren stark mit Wasserbelastung, vegetativem und Hormonstatus) und anderen Flüssigkeitsproben:

     Speichel (~1 l/d, Produkt der Parotis-, Sublingual- und Submandibulardrüsen, die unterschiedliche Mengen unterschiedlich zusammengesetzten, hypotonen Sekrets produzieren),

     Schweiß (dient primär der Kühlung durch Evaporation; bis mehrere l/d; normalerweise hypoton (niedriger Salzgehalt), Menge und Zusammensetzung physiologisch / medizinisch / diagnostisch bedeutsam),

     Tränenflüssigkeit (schützt Auge und Tränenwege, isoton, daher salzreich, enthält spezifische Schutzfaktoren),

     Liquor (Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, ~150 ml, isoton, Polsterungs- und chemische Stabilisierungsfunktion),

     Zervixsekret (Menge und Konsistenz zyklusabhängig),

     Verdauungssäfte (diagnostisch besonders bedeutsam Magensaft, Pankreas- und Gallesekret), u.a.

All diesen Flüssigkeiten kommen spezifische physiologische Aufgaben und Eigenschaften zu, und ihre Analyse gibt Aufschluss über die Funktion von Zellen, Geweben und Organen, die sich an ihrer Bildung (z.B. Leber), Veränderung und Entfernung (z.B. Nieren) beteiligen.

 
Messungen an Blutproben
 
Blut befördert Stoffe teils frei gelöst (wie Sauerstoff, Kohlendioxid, Stickstoff, Salze, Glukose, Harnstoff, Aminosäuren, Proteine), teils an Protein gebunden (Fette, Schilddrüsen- und Steroidhormone); Informationsstoffe (Hormone, Wachstumsfaktoren); und Wärmeenergie, die über Haut und Schleimhäute an die Außenwelt abgegeben wird.
 

<Abbildung: Die Körperlage beeinflusst die Zusammensetzung des Blutes
Quelle: iap

Versuchsperson am Kipptisch in Kopf-Tieflage, Abnahme einer Blutprobe aus Kubilatvene.
 
Im Vergleich zu aufrechter Körperlage (Sitzen, Stehen) nimmt die Konzentration vieler Blutkomponenten in liegender Position ab (Hämatokrit, Eiweißkonzentration), da es in den unteren Körperpartien zu Verlagerung von Gewebsflüssigkeit in die Blutbahn und damit Hämodilution kommt (vgl. dort).
 
Das Blutvolumen nimmt bei Wechsel von aufrechter zu liegender Körperposition innerhalb von Minuten um ~10% zu


Einzelne Proteine werden mittels Antikörpern bestimmt, die spezifisch mit ihnen reagieren (Immunoassay).

Weniger spezifisch ist die Elektrophorese:
Dabei wird die Plasmaprobe in ein elektrisches Feld gebracht. Die verschieden stark geladenen Eiweißfraktionen trennen sich in Gruppen (Fraktionen) auf. Im Allgemeinen lassen sich Albumin und mehrere Globulin-Fraktionen unterscheiden.

Albumin macht 60% der Plasmaeiweiße aus und besteht aus einer einheitlichen Molekülart. Es bewirkt 90% des kolloidosmotischen Effekts, ist ein Reserveeiweiß, und transportiert u.a. das Schilddrüsenhormon Thyroxin. Die Albuminkonzentration im Blutplasma beträgt 40-50 g/l.

Globuline sind vielfältig in molekularer Form und Funktion: Gerinnungsfaktoren, Antikörper, Komplementfaktoren, spezifische Transportproteine. Die Globulinkonzentration im Blutplasma beträgt 20-30 g/l.
 

>Abbildung: Bestimmung von Hämoglobingehalt, Zellzahlen und Zelltypen
Nach verschiedenen Vorlagen kompiliert

Bei automatisierten Blutanalysen werden Blutkörperchen aus einer verdünnten Blutprobe durch eine Messschranke geleitet. Dort verursachen sie Impedanzschwankungen, deren Größe mit dem Zellvolumen korreliert. Auf diese Weise können Erythrozyten- (~5 Mio / µl) und Thrombozytenzahlen (~0,3 Mio / µl) ermittelt werden.
 
Bei der automatiischen Analyse weißer Blutkörperchen (~5 Tausend / µl) kommt die Flusszytometrie zum Einsatz. Dabei werden die Impulse nach Zellvolumen und Granularität des Zellinhaltes zweidimensional "aufgespreizt" und mit hoher Treffsicherheit in Felder zugeordnet, die für die einzelnen Zelltypen definiert wurden (Monozyten, Polymorphkernige, Eosinophile, Lymphozyten).

  MCV, mean corpuscular volume   PMN = polymorphkernige Leukozyten (Graulozyten)

  Vgl. dort    

Zu physiologischen Faktoren, welche die Messwerte  beeinflussen können, gehören Art der Probe (z.B. arterielles vs. venöses Blut), Alter und Geschlecht, Tageszeit (z.B. unterschiedliche Hormonausschüttung mit zirkadianen Rhythmen), Lagerung des Körpers (liegend, aufrecht), Muskelaktivität u.a.

Blutbildung: Blutkörperchen werden im roten Knochenmark nachgebildet, Lymphozyten in lymphatischen Geweben. Ihre Vorstufen sind in Präparaten von Knochenmarkpunktat zu finden. Zytokine regulieren Differenzierung, Teilung und Reifung der Zellen zu Erythro-, Leuko- und Thrombozyten.
 

Im Gegensatz zu Erythrozyten und Thrombozyten, die vollzählig in der Blutbahn bleiben, befinden sich nur 5% der Granulozyten und 2% der Lymphozyten im Blut - der Großteil des “Leukozytenpools” hält sich im Gewebe auf.

Auch unterscheiden sich die Blutkörperchen in ihrer Lebensdauer:

  Erythrozyten 3 bis 4 Monate

  Thrombozyten und Granulozyten 1-2 Wochen

  Kurzlebige Lymphozyten 5-10 Tage, langlebige vermutlich mehrere Jahre.

Daraus folgt, dass Leukozyten und Thrombozyten viel schneller nachgebildet werden als Erythrozyten. Daher findet man im roten Knochenmark auch vor allem Myelozyten (Vorstufen weißer Blutkörperchen) und wenig Erythroblasten (Vorstufen roter Blutkörperchen).

 
Die Zahl der Blutkörperchen ist, wie die Aufrechterhaltung von Stoffkonzentrationen im Blut, ein Resultat eines Fließgleichgewichts zwischen Abbau und Neubildung.

 

<Abbildung: Giemsa-Färbung

In der Mitte ein segmentkerniger neutrophiler Granulozyt. Das Zahlenverhältnis zu Erythrozyten beträgt ungefähr 1 : 1700


Da sich Leukozyten hauptsächlich außerhalb der Blutbahn aufhalten (Granulozyten zu 95%, Lymphozyten zu 98%), kann eine Umverteilung zwischen intra- und extravasalen bzw. kapillär fixierten Leukozyten ebenfalls Änderungen der Leukozytenzahlen im strömenden Blut bedingen.
 
     Zum roten und weißen Blutbild s. dort
 
Aus Blutproben lassen sich zahlreiche Rückschlüsse auf Organfunktionen ziehen:

  
  Enzymkonzentrationen spiegeln eventuelle Störungen an Zellen wider, diese sind z.T. organspezifisch (Niere, Herzmuskel, Leber u.a.)

     Verschiedene Marker werden verwendet, um diagnostisch wichtige Kenngrößen wie z.B. Herzminutenvolumen (Indikatordurchgang), glomeruläre Filtration (Inulinclearance), Nierendurchblutung (PAH-Clearance) usw. zu quantifizieren.
 
Verwendung von Antikörpern
 
Immunoassays: Zahlreiche klinisch-diagnostische Labormethoden beruhen auf der Verwendung von Antikörpern, das sind Proteine mit hoher Bindungsspezifität. Sie erkennen Antigene und werden zu ihrer Detektion, Reinigung und/oder Quantifizierung verwendet. Antikörper können zum Nachweis praktisch jeden beliebigen Makromoleküls produziert werden.
 

>Abbildung: Radioimmunoassay
Nach einer Vorlage in Abbas / Lichtman / Pillai: Cellular and Molecular Immunology, 9th ed. 2018

Ein sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Eine definierte Menge immobilisierten Antikörpers wird zur Bindung des Antigens auf die Mikrotiterplatte fixiert (1). Damit wird das Antigen gebunden (2) und ein mittels eines anderen, markierten (rote Sternchen) Antikörpers ein anderes Epitop (damit es bei der Bindung nicht zu gegenseitiger Behinderung kommt) am Antigen gebunden (4).
 
Um nur gebundene Marker zum messen, werden überschüssige Antikörper abgewaschen (5); erst dann erfolgt die Messung (Radioaktivität, Farmbreaktion).
 
Wird das Verfahren mit mehreren bekannten Antigenkonzentrationen wiederholt, lässt sich eine Eichkurve (Standardkurve) ermitteln (6), anhand derer dann eine unbekannte Menge Antigen in einer fraglichen Bioprobe über den entsprechenden Markerwert der Standardkurve quantifiziert wird


Besonders treffsicher und reproduzierbar arbeitet man mit monoklonalen Antikörpern, d.h. solchen, die aus einem identen Lymphozytenklon stammen und daher exakt die gleiche Bindungsspezifität zu bestimmten Epitopen auf zu erkennenden Antigenen haben.

So können ganz bestimmte Bindungsmerkmale (Epitope) an (antigenen) Molekülen reproduzierbar dargestellt werden - in oder auf Zellen, im Gewebe, in Gelen oder in Lösung.

In letzterem Fall werden entweder Antikörper oder Antigene auf  Trägeroberflächen fixiert (Abbildungen) und mit dem in Lösung befindlichen Partner zur Reaktion gebracht. Da die Antigen-Antikörper-Reaktion an sich unsichtbar bleibt, wird eine Zusatzreaktion für die Indikation benötigt (Farbstoff, Enzym mit sichtbarer Folgereaktion, radioaktiver Stoff).

Bei diesem "Sandwich"-Verfahren spricht man im Fall der Verwendung eines Enzyms von ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), bei Verwendung eines radioaktiven Markers von RIA (Radioimmunoassay).

 

<Abbildung: "Antigen-Sandwich" ELISA
Nach Yucel F, Akcael E. Development of sandwich ELISA systems for the diagnosis of hepatitis B virus surface antigen and its antibody in human sera. J Microbiol Exp. 2018; 6: 77–8

Zuerst wird Antikörper gegen das nachzuweisende Antigen an eine Mikrotiterplatte aus Plastik (Festphase, microwell) gebunden (links). Dann werden (verschiedene Mengen von) Antigen zugesetzt und nicht gebundenes Antigen weggewaschen. Anschließend wird der Detektions-Antikörper zugesetzt (er erkennt ein anderes Epitop am Antigen als der erste Antikörper, die beiden Bindungen dürfen nicht interferieren).
  
An den Detektions-Antikörper ist ein Enzym gebunden. Nach abermaligem Waschen wird Substrat zugesetzt, die Umsetzung durch das Enzym ist proportional zur gebundenen Menge an Antigen.
  
Bei jeder Messung entsteht eine bestimmte Signalgröße (Fluorophore, Chemoluminiszenz). Durch Bestimmung der Signalgröße bei verschiedenen bekannten Antigenkonzentrationen ermitttelt man eine Standardkurve, anhand derer dann das Signal bei unbekannter Antigenmenge einer bestimmten Konzentration zugeordnet werden kann


Die ermittelte S-förmige Standardkurve stellt die Beziehung zwischen Konzentration des zu quantifizierenden Bindungspartners (Antigen oder Antikörper) und der Signalstärke (Farbintensität - Spektrophotometer, Radioaktivität - Counter) dar.
 

>Abbildung: "Antikörper-Sandwich" ELISA
Nach Yucel F, Akcael E. Development of sandwich ELISA systems for the diagnosis of hepatitis B virus surface antigen and its antibody in human sera. J Microbiol Exp. 2018; 6: 77–8

In diesem Fall wird Antigen an die Festphase gebunden. Verschiedene Seren mit bekannter Antikörperkonzentration werden aufgebracht, der Überstand jeweils weggespült und die Intensität des Messsignals registriert. Daraus wird eine Standardkurve erstellt. Das Prinzip ist ähnlich wie beim "Antigen-Sandwich": Anhand der Standardkurve kann die (unbekannte) Konzentration des betreffenden Antikörpers in Testseren quantifiziert werden.

Wenn statt eines Enzyms ein stabil strahlendes Isotop an den (Detektions-) Antikörper gebunden wurde, misst man die Radioaktivität


Es ghibt zahlreiche weitere Verfahren, die auf dem Prinzip der (quantifizierbaren) Antigen-Antikörper-Bindung beruhen:
 
Immunoblotting: Beim Western Blotting (blot = Klecks, Fleck) wird ein Proteingemisch (Körperflüssigkeiten bzw. Zellhomogenate) durch Gelelektrophorese (typischerweise SDS-PAGE) nach Molekülgröße aufgetrennt und die entstandenen "Blots" werden vom Polyacrylamidgel auf Mikrozellulose übertragen (fixiert). Antikörper binden an ihre Zielproteine, die so identifiziert, quantifiziert und gegebenenfalls separiert werden können. Das Verfahren kann verfeinert werden, indem ein Zwischenschritt mit Immunpräzipitation eingeschaltet wird.

  Mehr zum Western-blot s. dort
 

<Abbildung: Immunpräzipitation (oben) und Affinitätschromatographie (unten)
Nach einer Vorlage in Abbas / Lichtman / Pillai: Cellular and Molecular Immunology, 9th ed. 2018

Oben: Immunpräzipitation. Die Methode dient zur Identifikation, Reinigung und Quantifizierung eines Antigens. Aus einer Mischung verschiedener Antigene (in Serum oder anderen Flüssigkeiten) wird das gesuchte durch Bindung an den spezifischen Antikörper selektiert und anschließend separiert.
 
Unten: Affinitätschromatographie. Die Methode wird oft zur Isolierung löslicher Antigene aus einem Antigenmix verwendet (wie im Bild gezeigt). Ziel ist die Gewinnung reinen Antigens


Immunpräzipitation (<Abbildung oben): Einem Antigengemisch wird im Überschuss immobilisierter (an Kügelchen gebundener) Antikörper zugesetzt, der das Antigen bindet und aus dem Gemisch durch Zentrifugieren separiert wird.

Durch Änderung des pH-Werts oder der Ionenstärke der Lösung wird das Antigen von der Antikörperbindung befreit und in reiner Form dargestellt, wie mittels Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
 
Affinitätschromatographie (<Abbildung unten): Das Prinzip ist das gleiche - wie identifiziert und isoliert man ein gesuchtes Antigen? Die für das darzustellende Antigen spezifischen Antikörper sind an eine unlösliche Phase (unlösliche Kügelchen, oder Matrix der Chromatographiesäule) gebunden. Auch hier wird nach Zugabe der fraglichen Flüssigkeit (z.B. Serum) ungebundenes Antigen weggewaschen und schließlich das gereinigte Antigen gewonnen.
 
Durchflusszytometrie (Fluorescence-activated cell sorting, FACS) s. dort
 


  Klinisch-chemische Laborwerte / Referenzbereiche
 



Eine Reise durch die Physiologie


  Die Informationen in dieser Website basieren auf verschiedenen Quellen: Lehrbüchern, Reviews, Originalarbeiten u.a. Sie sollen zur Auseinandersetzung mit physiologischen Fragen, Problemen und Erkenntnissen anregen. Soferne Referenzbereiche angegeben sind, dienen diese zur Orientierung; die Grenzen sind aus biologischen, messmethodischen und statistischen Gründen nicht absolut. Wissenschaft fragt, vermutet und interpretiert; sie ist offen, dynamisch und evolutiv. Sie strebt nach Erkenntnis, erhebt aber nicht den Anspruch, im Besitz der "Wahrheit" zu sein.