Grundlagen und Methoden der Physiologie; molekulare und zelluläre Aspekte
 
Anwendung biophysikalischer und elektrophysiologischer Methoden

 
© H. Hinghofer-Szalkay

Elektro-: ἤλεκτρον = Bernstein (an ihm wurde die Elektrizität zuerst beobachtet)
enzephalo-: ἐγκέφαλον = Gehirn
-graphie: γραφή = Schrift, Aufzeichnung
myo-: μυς, μυός = Muskel
nystagmo-: νυσταγμός = Schläfrigkeit
oculo-: oculus = Auge
Patch-clamp-Technik: patch = Fleck, Pflästerchen (Membranausschnitt unter der Patch-Pipette); to clamp = festklemmen (den Membranpatch auf ein Potential)
retino-: rete = Netz (Retina = Netzhaut)
Aktionspotentiale, die durch erregtes Gewebe laufen, bewirken elektromagnetische Potentialschwankungen, die an Einzelzellen, Organen oder an der Körperoberfläche detektiert werden können. Dazu werden Ableiteelektroden (an Stellen) verwendet, die man als different (durch die interessierenden Potentialschwankungen wesentlich beeinflusst) oder als indifferent (davon weitgehend unbeeinflusst, aber zur Komplettierung eines Ableitekreises notwendig) bezeichnet.

Werden zwei differente Signale verglichen, handelt es sich um eine "bipolare" Ableitung (z.B. Einthoven-Ableitungen); ist nur eines different, ist die Ableitung "unipolar" (z.B. Wilson-Ableitungen des EKG).

Die Registrierungen werden meist nach der Quelle des Signals bezeichnet - z.B. Kardio-, Enzephalo-, Myo-, Okulo-, Retinogramm - oder nach der Art des erwarteten Musters (z.B. Nystagmogramm). Ein EKG ist also ein Elektrokardiogramm usw.

Die meisten klinisch verwendeten Ableitungen sind nichtinvasiv. Für spezielle Fragestellungen kann auch eine Elektrode in den Körper bzw. in das Gewbe eingeführt werden. Liegen die Elektroden extrazellulär, handelt es sich um eine extrazelluläre Ableitung; dringt eine (Glaskapillar-) Elektrode in die Zelle ein, um aus dieser den Potentialverlauf abzuleiten (neurophysiologische Forschung), um eine intrazelluläre Ableitung (das Membranpotential der Zelle wird dadurch messbar).


Übersicht Membranpotential differente / indifferente Punkte Ableitungen


>Abbildung: Patch-Clamp-Ableitung
Kombiniert nach: Apps R & Garwic M, Anatomical and physiological foundations of cerebellar information processing. Nature Rev Neurosci 2005: 6, 297-311; Firelight Media Group; und Wikipedia
An einem Fleckchen isolierter Zellmembran (hier von einem Neuron der Kleinhirnrinde) wird das Öffnungsverhalten einzelner Ionenkanäle bei vorgegebener Membranspannung untersucht (s. Text)

Biophysik untersucht die Rolle physikalisch beschreibbarer Mechanismen und Vorgänge in Zellen, Geweben und Organismen. Zu ihren Subdisziplinen zählen Biomechanik und Elektrophysiologie. Generelle Prinzipien und Methoden betreffen z.B. Masse, Bewegung (Newton'sche Gesetze), Optik, Akustik, elektromagnetische Felder, Strahlung etc.

Zahlreiche physikalische Größen spielen in einem physiologischen Zusammenhang eine Rolle und werden entsprechend bestimmt, z.B. Masse, Volumen, Strömung, Druck, Gassättigung, Temperatur, Wärmemenge, Schallstärke, Lichtintensität...
 
  Spezielle elektrophysiologische Ableitungen sind z.B. Elektro-Kardio- (EKG), -Enzephalo- (EEG), -Myo- (EMG), -Okulo- (EOG), -Retino- (ERG), -Nystagmo-Graphie (ENG).

  Zur Bestimmung der Nervenleitgeschwindigkeit (NLG) s. dort
 

 <Abbildung: Elektrophysiologische Versuchsanordnung
Ableiteelektroden am Daumenballen, Reizelektrode am Nerv. Nach elektrischer Reizung des Nerven können vom Muskel Aktionspotentiale abgeleitet werden


Die Zellmembran ist Angriffspunkt für Kontaktstellen zwischen mehreren Zellen, die der mechanischen Festigkeit dienen (zwischen Epithelzellen, Herzmuskelzellen) oder der Verbindung der Zellinnenräume, was den Austausch von Stoffen oder das Fließen von elektrischen Membranströmen ermöglicht (Weiterleiten von Aktionspotentialen: Signalfunktion). Solche Verbindungskanäle finden sich zwischen glatten Muskel- und Herzmuskelzellen und ermöglichen die Fortpflanzung von Aktionspotentialen, z.B. im Lauf eines Herzschlags.

Das Verständnis bioelektrischer Vorgänge beruht auf zellphysiologischen Grundtatsachen. Kaliumionen sind in der Zelle 30-mal höher konzentriert als extrazellulär. K+ diffundiert daher aus der Zelle und ladet die Membran zum Ruhepotential auf, innen negativ, außen positiv - die elektrische Spannung beträgt bis zu ≈90 mV (Millivolt).

Grundlage solcher elektrischer Potentiale sind Ionenbewegungen durch die Zellmembran. Diese werden durch komplex strukturierte Öffnungen ("Kanäle", "Permeasen") ermöglicht, die aus Proteinkomplexen aufgebaut sind und den Durchtritt von Ionen durch die ansonsten hydrophobe Grenzphase (Phospholipide!) erlauben, und zwar unterschiedlich für Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Kalzium- oder Magnesiumionen. Bei weitgehender Spezifität spricht man daher von Natriumpermeasen, Kaliumpermeasen etc.
  Das Ruhepotential der Zellen beruht im Wesentlichen auf einem Kaliumpotential.
  Das Verhalten einzelner solcher Membrankanäle lässt sich mit Hilfe der Patch-Clamp-Methode untersuchen (>Abbildung ganz oben): Mit einer sehr feinen Glaspipette saugt man ein Stückchen Zellmembran (ca. 1 µ2 Durchmesser) an und kann dann in vitro bei vorgegenener Membranspannung ("voltage clamp") die Bewegung von Ionen durch die Membran untersuchen.
 

Schon Luigi Galvani stellte um 1780 Zusammenhänge zwischen elektrischer und Muskelaktivität fest, und der deutsche Physiologe Emil Du Bois-Reymond konnte um 1840 „tierische Elektrizität“ nachweisen und präsentierte 1849 Ableitungen elektrischer Muskelaktivität. Seine Forschungen waren die Grundlage zur Entwicklung elektromedizinischer Diagnosemethoden wie EKG, EEG und EMG. 1922 entwickelten Joseph Erlanger und Herbert Gasser ein Oszilloskop, mit dem Muskelaktionspotentiale aufgezeichnet werden konnten.

In die klinische Routine fanden EEG, EMG etc. erst später im 20. Jahrhundert Eingang, insbesondere mit der Entwicklung moderner Elektronik


Reiz: Das Ruhepotential ändert sich, wenn eine Zelle gereizt wird. Ein Reiz ist ein Einfluss, der das Membranpotential - durch Veränderung von Ionenleitfähigkeit - verändert. Ein Reiz kann das Potential erhöhen (Hyperpolarisation) oder verringern (Depolarisation der Membran).

Ein Reiz ist - allgemeiner gefasst - jede Veränderung von Umgebungsbedingungen, auf die ein lebendes System (Zelle, Organ, Organismus..) reagiert, d.h. auf den Reiz mit veränderten Eigenschaften / Aktivitäten antwortet. Bei der Untersuchung physiologischer Systeme werden Reiz-Reaktions-Muster zur Analyse derer Eigenschaften herangezogen - qualitativ und quantitativ.

Ist der Reiz nicht alleine (wie in einer artefiziell-experimentellen Untersuchungssituation), sondern wirken mehrere Reize gleichzeitig / kurz nacheinander auf das System ein (was in der Realität die Regel ist), wird die Sache zunehmend komplex, und es wird immer schwieriger, die physiologische Antwort auf eine gegebene Reizkombination vorherzusagen. Ähnlich wie bei einer Wettervorhersage können bei mehrmaliger Simulation mit denselben Anfangsbedingungen unterschiedliche Resultate herauskommen.

Das trifft z.B. auch auf die Kombination mehrerer Medikamente (Polypharmazie: gleichzeitiger Gebrauch mehrerer Arzneimittel) zu - auch bei gutem Verständnis der Dynamik und Kinetik der Einzelsubstanzen kann die Wirkung mehrerer synchron und/oder über längere Zeit verabreichter Pharmaka zusehends schwer voraussehbar sein.
 



<Abbildung: Intrazelluläre Ableitung der elektrischen Aktivität von verschiedenen Stellen (2x Dendriten, 1x Soma) einer kortikalen Nervenzelle
Strichlierte Line: Nullpotential. Der Abstand der Mikroelektroden vom Soma ist in µm angegeben

  Membranpotentiale bzw. elektrische Erregungsmuster können aus dem Gewebe mittels Ableite-Elektroden dargestellt werden, die mit einem Verstärker- bzw. Registriersystem verbunden sind. Dabei unterscheidet man
    "differente" Elektroden bzw. Positionen, d.h. solche, deren Potential durch das interessierende Biopotential (bzw. dessen Veränderung) wesentlich beeinflusst wird und dieses darstellen;

     "indifferente" Elektroden bzw. Positionen, die einen Vergleichswert liefern, der nicht mit dem interessierenden Biopotential (dessen Veränderung) variiert.

 Beispiel: Bei den Wilson-Brustwandableitungen des EKG stellen die Brustwandelektroden die differenten Ableitepositionen dar; der Zusammenschluss der drei Extremitätenpotentiale (von rechtem und linkem Handgelenk sowie linkem Fußgelenk) ergibt ein indifferentes Vergleichspotential.


>Abbildung: Saugelektrode

  Eine "Ableitung" stellt immer den Vergleich des elektrischen Potentials an zwei Positionen dar, an denen Ableiteelektroden liegen. Da es differente und indifferente Ableitungspositionen gibt, unterscheidet man
  unipolare Ableitungen, d.h. solche, welche das Potential einer differenten Position mit dem einer indifferenten Position vergleichen (z.B. Wilson-Ableitungen des EKG);

  bipolare Ableitungen, d.h. solche, welche das Potential einer differenten Position mit dem einer zweiten differenten Position vergleichen (z.B. Einthoven-Ableitungen des EKG).
 

<Abbildung: Ableitung eines Membranpotentials
Dringt die (mit einer Elektrolytlösung gefüllte) Mikroelektrode in die Zelle ein (roter Pfeil), wird das Potential über die Membran sichtbar (hier: Ruhepotential - grüne Kurve)

  Invasivität: Elektrophysiologische Ableitungen können - von der Haut - nichtinvasiv erfolgen, was den Vorteil der Schmerzfreiheit und Ungefährlichkeit hat (kaum Infektionsgefahr, keine Verletzung), aber den Nachteil schwächerer und weniger klarer elektrischer Signale (Dämpfung durch dazwischenliegendes Gewebe mit entsprechendem elektrischen Widerstand und elektrischer Kapazität, d.h. Ladungsaufnahme).

Bringt man die Elektroden ins Gewebe ein, ist die Ableitung invasiv. Solange die Elektrode nicht in eine Zelle eindringt, bleibt die Ableitung extrazellulär, sie kann z.B. die Potentialdifferenz zwischen erregtem ("entladenem") und unerregtem Gewebe erfassen.

Sticht man eine Glaselektrode durch die Außenmembran einer Zelle (<Abbildung), wird das Membranpotential messbar (innen gegen außen - intrazelluläre Ableitung, s. unten) - vorausgesetzt, die Zelle "überlebt" diesen Vorgang (was umso wahrscheinlicher ist, je größer die Zelle bzw. je feiner das Ableitesystem ist).

Genaue Untersuchugen z.B. des Zusammenspiels zahlreicher Nervenzellen in ihrem physiologischen Verbund sind Beschränkungen unterworfen; so lassen sich solche komplexen Fragestellungen an Schnittpräparaten durchführen, deren Neuronen in vitro für einige Zeit weiterleben, wie in der >Abbildung (Untersuchung eines Hippokampuspräparates) gezeigt.
 

>Abbildung: 0,4 mm dickes Hippokampuspräparat (Ratte)
Die Nervenzellen sind im Wesentlichen mit ihren lokalen Verbindungen im Präparat erhalten. Mikroelektroden dienen dazu, Zellen gezielt zu reizen und elektrische Aktivitäten abzuleiten. Die resultierenden Muster erlauben ein besseres Verständnis zugrundeliegender physiologischer Verschaltungsmechanismen

Die Aussage der Resultate solcher Untersuchungen ist entsprechend beschränkt, weil über das Präparat ursprünglich vorhandene Verbindungen zu entfernter liegenden Neuronen durch die Präparation naturgemäß zerstört worden sind. Andererseits ist die Interaktion mehrerer Zellen so komplex, dass es mit zunehmender Größe von Präparat und Fragestellung immer schwieriger wird, sinnvolle kausale Strukturen festzumachen (s. auch dort).

Durch Anwendung sogenannter Multiple Microelectrode Arrays kann eine synchrone Vielkanal-Ableitung von zahlreichen (wie auf einem Schachbrettmuster angeordneten) Ableitestellen Aufschluss über die Kommunikation mehrerer unverletzter Neuronen bringen (die gleichzeitig unter dem Mikroskop beobachtet werden können). Auf diese Weise sind gleichzeitig mehrere hundert Registrierungen der neuronalen Aktivität eines Nervenzellverbandes möglich.

Zwischen extrazellulären und intrazellulären Ableitungen bestehen folgende Unterschiede:

     Bei extrazellulären invasiven Ableitungen liegen beide Ableiteelektroden im Extrazellulärraum, die elektrisch aktiven Zellen werden (meist) nicht verletzt. Sie eignen sich zur Darstellung von Entladungsmustern und bieten präzisere Bilder als Ableitungen von der Körperoberfläche (näher am Ort der Ladungsveränderungen: höhere Feldstärken, weniger Widerstand, aktive Zellen im Ableitungsbereich weniger zahlreich → elektrische Muster klarer interpretierbar). Das transmembranale Potential ist auf diese Weise nicht erfassbar

     Intrazelluläre Ableitungen erfordern das Eindringen einer der beiden (Mikro-) Elektroden in eine elektrisch aktive Zelle (Abbildungen). Solche Ableitungen sind technisch schwierig zu bewerkstelligen, können aber das transmembranale Potential (Ruhepotential,..) darstellen. Mikroelektroden, die intrazellulär positioniert werden, werden aus Glas gefertigt und sind im Regelfall mit einer Flüssigkeit befüllt, welche in ihrer ionalen Zusammensetzung der intrazellulären entspricht und die Membran bzw. deren Ladung möglichst wenig beeinflusst.
Eine Reise durch die Physiologie


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